《Nature》重磅——为何又犯困？磷酸化修饰组再建新功
2018-06-29
中科新生命
3596为什么有些人只要睡五个小时就能神采奕奕，有些人睡十个小时仍然哈欠连天？很多时候我们不受控制的瞌睡了，埋怨为何又犯困？6月14日，来自刘清华教授（德克萨斯大学西南医学中心）共同主导的科研团队在最新一期的顶尖学术期刊《Nature》上发表文章，研究人员利用基于质谱的蛋白磷酸化修饰组这一高端利器，提出了睡眠分子调控的新理论，从全新的角度回答了“生物为何需要睡眠”这一重要科学问题。
犯困，用官方术语来说即睡眠需求，它是维持睡眠至清醒稳态的重要过程，它的特点为在清醒期间积聚并在睡眠期间消散。两年前，该团队就曾发现了一种嗜睡突变小鼠，它们具有极高的睡眠需求，研究发现这些嗜睡小鼠平均每天竟多睡了5个小时！！为了进一步研究睡眠需求的机理，研究人员通过定量蛋白组学和定量修饰蛋白组学的方法，以高睡眠需求小鼠为模型，最终发现睡眠需求与脑蛋白质组磷酸化水平的关系。
研究路线
首先，研究人员使用了两种高睡眠需求的小鼠模型进行研究，1）睡眠剥夺小鼠模型，其通过剥夺野生型小鼠（C57BL/6N）的睡眠，引起极高的睡眠需求。2）嗜睡小鼠模型，其SIK3基因突变（SIK3 Slp/+），导致即使给予睡眠却仍有极高的睡眠需求。随后，研究人员对分别对两种模型中各组的全脑组织样本进行定量蛋白组和定量磷酸化修饰组的检测，以期寻找差异（设计线路如图1）。
图1.实验设计图。蓝色虚线框，睡眠剥夺组：睡眠充足6小时组（S6）；睡眠剥夺6小时组(SD6)；睡眠剥夺6小时后补睡3小时组（RS3）。黄色虚线框，嗜睡小鼠组：对照组野生型WT（Sik3 +/+）；困倦组突变型Slp（Sik3Slp/+）。绿色虚线框，定量蛋白组和定量磷酸化组的分析流程。
研究结果
1．寻找差异表达蛋白：在组学分析之前，其实研究人员初步挑选了14种磷酸化底物蛋白进行免疫印迹（WB）验证，并发现5种蛋白水平在犯困的小鼠中上调。因此，研究人员希望通过蛋白质组学的方法，以期找到更多蛋白水平的差异。But，研究人员并未在蛋白水平上找到有意义的变化!!（巧合的是，本平台近期已经完成的其他脑疾病模型的多个蛋白质组的分析，也得到了类似的结果，即似乎脑组织的病生理变化，似乎不明显体现在蛋白表达水平）所谓山重水复疑无路，柳暗花明又一村。蛋白水平没有变化，并不能代表其他水平没有变化，比如翻译后修饰。众所周时，磷酸化修饰可是能够在不改变蛋白水平的基础上参与调控蛋白功能，在各种生命活动中发挥作用。那么磷酸化修饰是否可能在困倦时发生变化？随后，研究人员通过磷酸化修饰组的定量分析，发现犯困的两种小鼠模型中许多蛋白的磷酸化水平显著升高！！
图3.火山图分析不同组中的蛋白肽段（上图）、磷酸化修饰肽段（下图）水平变化。（A）困倦型Slp /野生型WT，(B)睡眠剥夺组SD6/ 补睡组RS3，(C)睡眠剥夺组SD6/ 睡眠充足组S6
2．筛选差异蛋白：得到可喜可贺的那么多磷酸化修饰差异蛋白后，接下来问题就是如何筛选差异蛋白？研究人员通过开发的独特∆Ps分析方法，筛选出整体上磷酸化程度变化最大的80个蛋白（命名为Sleep-Need-Index-Phospho Proteins，SNIPPs）。更加惊喜又意外的是，这80个蛋白中竟有69个蛋白是突触相关蛋白，如此成功的差异筛选再次将睡眠与突触稳态联系到了一起。
3．差异蛋白验证：通过差异筛选，研究人员惊喜的发现了80个差异蛋白SNIPPs，那么接下来则需要进一步实验探究。研究人员设计了两种方法进行后续探究。首先，他们通过设置睡眠剥夺时间梯度以逐步增加睡眠需求（0、1、3、6小时组）,实验证实了SNIPPs磷酸化水平确实随着睡眠剥夺时间的增加而逐渐积累。随后，他们利用MK801处理增加小鼠睡眠需求，MK801通过抑制NMDA受体促使小鼠睡眠的慢波强度极大增加，实验同样验证了SNIPPs蛋白磷酸化水平随MK801处理而升高。
4．寻找犯困机制：Sik3是一个蛋白激酶，而其Sik3突变嗜睡小鼠会更久的维持SNIPPs磷酸化水平，提示Sik3可能参与SNIPPs磷酸化的调控。利用免疫共沉淀联合质谱分析，研究人员发现Sik3突变蛋白可能通过增强了与神经突出蛋白的联系（包括28个SNIPPs），从而更久维持SNIPPs磷酸化水平。最后，研究人员利用抑制剂处理以抑制Sik3激酶活性，结果发现嗜睡小鼠、睡眠剥夺小鼠中SNIPPs蛋白磷酸化水平有所降低，并且睡眠需求（慢波强度）也有所降低，以上结果证明了Sik3与SNIPPs蛋白磷酸化参与了睡眠需求。
小编心得
该研究利用组学分析这一利器去尝试探究“为何会犯困”这个有趣又关键的问题，为我们进一步研究神经突触稳态与睡眠稳态的关系提供了重要的线索。该研究采用的是蛋白质翻译后修饰探究的典型模式，主要路线：“样本选择 → 磷酸化修饰组定量分析 → 筛选差异蛋白，并验证表达变化→ 机制探究”。
通过磷酸化修饰组的高通量分析筛选修饰水平差异的蛋白，进而将神经突触稳态与睡眠稳态联系起来，最终还顺藤摸瓜地进行犯困的机制探究，为修饰组学研究提供了值得借鉴的思路。同时，该研究还开拓了新的研究思路，即在很多情况下，大家往往关注蛋白表达水平的变化，然而很多生物过程实际上可能与磷酸化修饰的调控更为重要，翻译后修饰是大家揭示全新生物机制的重要研究方向。
图4. “磷酸化/去磷酸化循环调控”论。红色部分，清醒状态下的活动促使SNIPPs磷酸化水平特异性的升高，其磷酸化的程度决定了清醒过程持续时间和清醒程度。蓝色部分，睡眠本身则提供了特异的机制促使SNIPPs蛋白去磷酸化，同时起着修复大脑损伤、参与记忆的形成和巩固过程。
看完着这篇研究，不知各位老师是否对磷酸化修饰产生了浓厚的兴趣。感兴趣的老师可以关注我们的【翻译后修饰】专栏，其中我们已经对磷酸化的功能意义、研究模式和套路、数据解读做过详细论述。感兴趣的老师可以点击下方链接进行查看。
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