项目文章（IF 9）| 华南农业大学采用TMT蛋白组破译紫外线诱变导致金龟子绿僵菌抗紫外线、耐高温、杀虫时间缩短新机制
2023-01-16
中科新生命
1048
金龟子绿僵菌是一种商业化并广泛用于防治各类害虫的生防真菌，但在生产实践中杀虫作用缓慢、防治效果不稳定、易受环境中的高温和强紫外线等因素的影响，在一定程度限制了其大规模的应用。目前通过诱变改良菌株的方式可提高绿僵菌快速杀虫的能力，但其中的诱变机制却不尽完善。
2022年10月，华南农业大学黄振研究团队在Microbiology Spectrum（Q1, IF=9.04）上在线发表了题为“Proteomic analysis of a hypervirulent mutant of the insectpathogenic fungus Metarhizium anisopliae reveals changes in pathogenicity and terpenoid pathways” ,同年在Environmental Microbiology发表了题为“Mutation of a prenyltransferase results in accumulation of subglutinols and destruxins and enhanced virulence in the insect pathogen, Metarhizium anisopliae”的研究论文，该研究利用TMT蛋白组学揭示了次级代谢产物生物合成途径中的萜类代谢在紫外线诱变影响真菌毒素代谢产物、增强诱变菌株抗强紫外线和耐高温性能、大幅缩短杀虫时间方面起着关键作用，萜类代谢途径中的FPPS1和GGPPS5基因可作为筛选抗强紫外线、耐高温、大幅缩短杀虫时间的有效基因靶点。该研究为解析紫外线诱变机制提供了新思路。中科新生命为该研究提供了TMT蛋白质组学技术服务。
研究材料
金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）野生菌株及其紫外线诱变菌株
技术路线
步骤1：诱变菌株的蛋白质组学分析及差异蛋白的代谢通路分析；
步骤2：萜类代谢途径中差异表达蛋白及对应基因的突变序列分析；
步骤3：FPPS1和GGPPS5基因敲除对菌株抗紫外线和耐高温、毒力、杀虫时间的影响；
步骤4：敲除突变体中次级代谢产物毒素变化的检测与分析。
研究结果
1. 紫外线诱变菌株中的蛋白质组学分析及差异蛋白的代谢通路分析
前期研究表明诱变菌株具有抗紫外线、耐37℃高温的优异性能，对小菜蛾的杀虫时间缩短、毒力也明显提升，同时诱变菌株的次级代谢产物发生明显变化。为了查明紫外线诱变对菌株抗逆性和毒力的影响机制，作者对菌株诱变前后进行了TMT蛋白质组学分析，结果显示：有842个蛋白表达发生明显改变，其中上调差异表达蛋白360个、下调差异表达蛋白482个。 KEGG通路、GO功能和PPI蛋白互作分析发现，这些差异表达蛋白质主要涉及biosynthesis of secondary metabolites, biosynthesis of amino acids, ribosome, carbon metabolism，steroid biosynthesis和terpenoid backbone biosynthesis等生物合成代谢途径（图1和图2），主要参与了metabolic process, cellular process, localization，biological regulation 和regulation of biological process等重要生物学过程（图2）。
图1 诱变菌株差异表达蛋白质相互作用网络
注：A. biosynthesis of amino acids, B. biosynthesis of secondary metabolites, C. terpenoid backbone biosynthesis, D. steroid biosynthesis.
图2 诱变菌株差异表达蛋白质GO功能富集分析
2. 诱变菌株萜类生物合成代谢途径中蛋白酶的表达发生明显变化，对应的基因发生突变
经蛋白组学比较分析发现菌株诱变前后的萜类生物合成代谢途径（terpenoid biosynthesis pathway）中蛋白酶类的表达发生了明显的变化，其中甲羟戊酸途径（MVA）中有11种蛋白酶的表达发生了明显的上调或下调（表1），进一步基因测序比对分析发现有4个蛋白对应的基因发生了突变、5个蛋白对应的基因没有突变，其中，紫外诱变株的FPPS1（A0A0B4FZV1）和GGPPS5（A0A0D9NRB6）合成酶基因的ORF序列分别发生了22 bp和1032/315 bp的突变，GGPPS5蛋白中有5个氨基酸发生了突变。这个发现为解析紫外线诱变机制提供了新的认识。
表1 诱变菌株的萜类代谢途径中相关蛋白和基因突变分析
3. 敲除FPPS1和GGPPS5基因提高了菌株抗紫外线和耐高温性能、大幅缩短了杀虫时间
敲除目标基因FPPS1 / GGPPS5后，突变体抗紫外线和耐高温性能明显增强，在强紫外线下照射40分钟、37℃高温下敲除突变体的孢子萌发时间显著缩短（图 3）。敲除突变体的孢子萌发时间提前1-3 h、GT50（50%真菌孢子萌发所需时间）缩短了2 h以上。敲除FPPS1 / GGPPS5基因后绿僵菌突变体的杀虫时间大幅缩短（敲除突变体对褐飞虱成虫的LT50=3.27 / 3.09 d，野生菌的LT50=5.90 d），敲除突变体菌株比野生菌株的毒力提高了10~100倍（LC50减少倍数）（表2）。这个发现为筛选抗紫外线和耐高温的诱变菌株提供了新的基因靶点。
图3 在高温和紫外线下绿僵菌野生型（WT）和敲除突变体ΔFPPS1/ΔGGPPS5的孢子萌发情况
注：GT50为50%真菌孢子萌发所需时间，IT50为50%孢子在高温或紫外线下的萌发率与常规条件下孢子萌发率的比值，MaUV-HV为诱变菌株。
表2 诱变菌株和野生菌株的生物测定
4. 目标基因ΔFPPS1/ΔGGPPS5敲除突变体中的次级代谢产物毒素发生了改变
经GC/LC-MS检测分析，目标基因ΔFPPS1/ΔGGPPS5的敲除突变体菌株次级代谢产物中的绿僵菌素A、B、C、D、A2等真菌毒素发生了明显的变化，其中有些毒素的含量增加10-100倍，Analog 45则在诱变株的次级代谢产物中消失了（表3）。
表3 绿僵菌野生型（WT）和敲除突变体ΔFPPS1/ΔGGPPS5菌株中的代谢产物
华南农业大学杀虫真菌研究团队黄振老师为论文的通讯作者，美国佛罗里达大学的Nemat O. Keyhani教授为论文共同通讯作者；华南农业大学的硕士生黄文友、余丹和本科生黄沛铨为共同第一作者；华南农业大学的硕士生李成周、佛罗里达大学的黄帅帅博士、广州市食品检验所的戚平研究员和黄松参与了本研究。
论文链接：
https://doi.org/10.1128/spectrum.00760-22
https://doi.org/10.1111/1462-2920.15859
小编小结
作者提供了绿僵菌萜类生物合成代谢途径中FPPS1/GGPPS5基因突变或敲除后，突变菌株的抗紫外线和耐高温性能增强、次级代谢产物毒素发生改变、菌株毒力提高、杀虫时间大幅缩短的证据。从机制上讲，FPPS1/GGPPS5基因突变或敲除、改变了绿僵菌萜类生物合成代谢途径中的类异戊二烯化合物等中间代谢产物的流向，影响了萜类生物合成及其相关的其它代谢产物生物合成代谢途径的正常代谢，从而导致绿僵菌次级代谢产物毒素的改变，最终提高了菌株的毒力、大幅缩短了杀虫时间。这个发现为解析紫外线诱变机制提供了新的认识，为筛选抗紫外线和耐高温的高毒力诱变菌株提供了新的基因靶点。为调控杀虫真菌的毒素代谢、提高菌株毒力和大幅缩短杀虫时间提供技术支撑，为杀虫真菌的改良与高毒力菌株的筛选提供参考。
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