新闻资讯

项目文章J Exp Clin Canc Res (IF 13) | 女神节特刊!DIA联合单细胞技术揭秘不同时期宫颈癌肿瘤微环境

2023-03-08
中科新生命
958

宫颈癌(CC)是全球女性第三大常见癌症,人乳头瘤病毒(HPV)16和18占CC的70%以上。I期CC细胞已经从子宫颈表面生长到更深的组织,而II期癌细胞有4厘米或更大,生长在子宫颈和子宫之外,但还没有扩散到骨盆壁或阴道下部。多组学和单细胞RNA测序技术的最新进展对肿瘤微环境(TME)的特征研究做出了重大贡献,从而发现了更多的细胞类型及其对治疗的反应。然而,目前对不同CC期TME的所有细胞类型进行分析以了解其细胞生物学的研究仍然有限。

2023年1月,佛山市第一人民医院刘晓松老师团队和袁颂华老师团队Journal of Experimental & Clinical Cancer Research(IF 12.658)发表了题为“Single-nucleus RNA sequencing and deep tissue proteomics reveal distinct tumour microenvironment in stage-I and II cervical cancer“文章,该研究利用snRNA-seqDIA蛋白质组学分析比较了I期和II期CC患者TME内的细胞异质性和功能,并为开发诊断CC和治疗免疫抑制性TME的新方法奠定了基础。其中,中科新生命为该研究提供了DIA定量蛋白质组学服务。

 

 

 研究样本

I期与II期CC患者的肿瘤组织

 

 

 研究思路

步骤1:鉴定I期和II期宫颈癌的肿瘤细胞组成;

步骤2:CCI组与CCII组间的细胞组成差异及细胞群差异表达基因分析;

步骤3:DIA定量蛋白质组学分析显示CCII患者存在明显的免疫抑制。

 

 

 研究结果

1. 鉴定I期和II期宫颈癌的肿瘤细胞组成

作者首先对I期(n = 4)和II期(n = 3)供体肿瘤组织中分离的所有核(42928个I期和29200个II期)进行了snRNA-seq实验,并通过聚类分析将所有细胞分类成了22种细胞类型,且在I期和II期CC组中都存在。接着作者通过分析每类细胞群的差异表达基因,并结合文献中已标注的标记基因,对细胞群进行注释。注释结果显示,这22类细胞群与免疫反应直接相关的细胞有T细胞、巨噬细胞(MΦ)、γδT细胞、初始B细胞、成熟B细胞、Treg、NK细胞、CD141+CLEC9A+ DC细胞、pDCs,干细胞类型的有癌症干细胞(CSCs)、间充质干细胞(MSCs)、血管干细胞(VSCs)、祖细胞,此外还有上皮细胞、淋巴内皮细胞、肌成纤维细胞等。

图1 I期和II期宫颈癌患者肿瘤组织的snRNA-seq分析

 

2. CCI组与CCII组间的细胞组成差异及细胞群差异表达分析

在得到细胞群的注释结果后,作者进一步分析CCI组和CCII组间的细胞组成差异以及细胞亚群的差异表达基因。新的转录本AC244205.1被发现是CCII组中多种细胞类型如DCs、MΦs、T细胞、MSCs、NPCs和GMPCs中上调最多的DEGs之一,提示其可能在CC的进展中发挥作用。在CCII组多种细胞类型中,与线粒体呼吸机制相关的DEGs如MT-CYBMT-CO2MTCO3MT-ND1MT-ND2MT-ND4的表达均升高,这意味着呼吸链上细胞色素的激活,导致了高水平的线粒体生物合成,这可能是由于肿瘤细胞生长在II阶段相对于I阶段的有显著的能量消耗,如EMT、“肌生成”、“缺氧”以及snRNA-seq分析表明的多种代谢过程

CCI患者的MΦs显示出促炎功能,这表明IFN-α和IFN-γ反应信号显著激活,而CCII患者的MΦs显示出与细胞生长和组织发育相关的许多通路激活,其巨噬细胞主要表型为免疫抑制和促肿瘤生长。IGLL5是CCII组MΦs中随胶原和线粒体基因上调的DEG。值得注意的是,MMP11在CCII组的MΦs中几乎是独一无二的。MMP11在CC细胞系和宫颈前病变中过度表达,在乳腺癌中,MMP11的表达被认为是预后的生物标志物,这意味着类似的MMP11过程可能发生在CCII组的TME中。此外,CCL19IL7RSPARCMGPLUMCXCR4在CCII组的MΦs和各个MΦ亚型中均高表达

图2 CCI组和CCII组的MΦs显示不同的免疫应答水平

图3 CCI组和CCII组巨噬细胞异质性分析 

实验结果中共鉴定出CD8+ T、γδT和Treg三种T细胞群。CCII组CD8+ T细胞的比例(12.85%)明显高于CCI组(8.58%),然而尽管CCII组的CD8+ T细胞的数量明显更多,但其T细胞具有更强的免疫抑制作用。此外,CCI组的γδT细胞表达了许多干扰素诱导的基因和受体,而Treg和γδT的数量在CCII组中大幅减少。γδT细胞被发现可以抑制肿瘤生长,γδT细胞数量的显著减少可能与II期CC的高度肿瘤发生有关。这些结果表明CCII患者TME中T细胞功能受到抑制

图4 CCII组患者的T细胞活性较低

CCI组的pDCs群体更高,而CCII组的B细胞群体更丰富。免疫反应,特别是MHC类I通路,在CCI组的DCs和B细胞中更为明显,而在CCII组的TME中,B细胞和DCs表现出MHC I类抗原的抑制过程

图5 CCI组TME中的B细胞和DCs表现出增强的MHC类I通路

NK细胞的数量分别占CCI和CCII细胞的2.52%和0.85%。与CCI组相比,CCII组NK细胞的比例降低了60%以上,其中许多标志NK细胞功能激活的DEGs上调,尤其是成熟NK细胞和CD56bright NK细胞。CCI组显示出显著的“INF-γ反应”和“异体移植排斥反应”途径的高度激活。CCII组中最丰富的通路与细胞组织和组织发育有关,可能与更活跃的肿瘤生长有关。这对NK发育的二阶段NK细胞尤其显著,EMT通路的明显激活主要归因于CCII组FBN1FN1SERPINE1VCAN等多种胶原蛋白的上调。因此,作者推测NK细胞中胶原的高丰度可能是对II期CC的TME中极低NK细胞数量的响应,以招募更多活性NK细胞

图6 CCII患者TME中NK细胞功能受到抑制

在CCI组和CCII组中,与肿瘤进展相关的其他几种细胞类型,包括干细胞和上皮细胞,被确定为最高的种群。在CCI组的几种干细胞类型中,免疫反应相关通路普遍富集,而在CCII组中,细胞和组织生长以及代谢通路高度激活

图7 肿瘤相关干细胞(TASCs)和上皮细胞在CCI患者的TME中更具有免疫反应活性

 

3.  DIA定量蛋白质组学分析显示CCII患者存在明显的免疫抑制

对CCI和CCII组进行DIA定量蛋白质组学检测,共鉴定出6181个蛋白质组。此外,作者根据DEPs和DEGs的FC值评估蛋白质谱与细胞类型之间的相关性,总的来说,相对于CCI患者,CCII患者形成了更强的免疫抑制TME。

GSEA分析显示,CCI组IFN-α和γ反应的激活与通过snRNA-seq分析得到的结果一致,特别是在免疫细胞类型中。CCII组DEPs上调与细胞外基质、细胞和组织发育及代谢密切相关,提示肿瘤发生程度更高。AKT1是相互作用程度最高的节点DEP。FN1是CCII组中与其他多个DEP相互作用上调最多的DEP,研究表明FN1通过激活FAK信号通路促进CC的发生。在CCI组DEPs上调方面,有一大群相互作用强烈的组蛋白,包括H2A/H2B和H4成员,它们在转录、DNA复制和修复中发挥重要作用。作者发现组蛋白基因可以作为CC患者生存预测的独立预后因素,包括本研究中检测到的HIST1H4A、HIST1H4E和HIST1H4K。这表明其他组蛋白也可以作为标志物,联合CCI组中上调的其他DEPs,如HSPs和干扰素反应相关蛋白,可用于早期发现CC

图8 CCI (n = 3)和CCII (n = 3)患者肿瘤组织的定量蛋白质组学比较

 

 

 小编小结

本研究通过使用snRNA-seq和DIA定量蛋白质组学,比较研究了I期和II期CC患者的TME。实验结果表明,II期CC患者几乎所有免疫细胞(包括MΦs、T细胞、B细胞、NK细胞和树突状细胞)的异质性都在很大程度上被调节,其表型明显具有免疫抑制作用。相比之下,这些细胞在I期CC患者中表现出增强的免疫反应,其中INF-α和γ反应是最激活的信号通路。此外,一些组蛋白显示出早期诊断CC的潜力。值得注意的是,对于II期CC患者,多种细胞类型的snRNA-seq分析和蛋白质组学分析分别鉴定出胶原蛋白的显著上调,提示它们可能被用作预后标志物。另外,本研究首次揭示了新型转录本AC244205.1的异常表达与II期CC的相关性。综上,这些发现为CC的临床诊断和免疫治疗提供了重要线索。

 

 

 

特别福利

 

为支持女性健康事业发展,即日起至4月30号,中科新生命对女性健康相关研究(包括但不仅限于乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌等研究)征集合作项目,对征集入选的合作项目给予75折优惠!

如果我们的支持计划能够解决您的需求,欢迎老师联系当地销售或扫描下方二维码申请,我们将竭诚为您服务!

*本计划最终解释权归上海中科新生命生物科技有限公司所有。

 

 

 

中科优品推荐

【中科新生命】自推出DIA技术服务以来,已完成了超万例样本的检测,项目经验丰富。此外公司也可提供DIA+PRM+机器学习一站式的标志物研究服务,以及基于肿瘤的蛋白基因组分型研究、常规机制研究的完整解决方案。欢迎感兴趣的老师来咨询!