JEM（IF 17.579）| 密歇根大学利用单细胞转录组揭示改变胰腺癌免疫微环境可以增强治疗效果

16个样本的PDA患者单细胞转录组数据集（PDA组织和配对的血液样本）
3个样本的小鼠的单细胞转录组（组织样本）

为了了解WNT通路在胰腺中的表达情况，作者选择了课题组先前发表的临床PDA组织的单细胞数据集进行分析。然后在单细胞的结果上展示了WNT通路中基因的表达水平，结果显示Tcf7基因（编码TCF1蛋白）在CD4+T细胞中表达量最高。并且在这16个PDA患者配对的PBMC样本中展示出了同样的现象。为了确定Tcf7的表达模式具有物种保守性，作者又选择了3只小鼠（healthy=2，mPDA=1）进行单细胞测序，通过数据分析共鉴定出了15种细胞类型。进一步分析显示，相比较健康的小鼠，Tcf7基因在mPDA模型CD4+T细胞中表达的水平更高。这一结果与患者样本的单细胞数据结果相吻合。

TCF1最初被认为是T淋巴细胞特异性转录因子，在T细胞的发育和分化中起着关键作用。因此，基于单细胞的数据分析结果，作者设想TCF1在PDA中具有调节CD4+ T细胞的免疫抑制功能。接下来，作者设计了Tcf7敲除模型。经过一段时间培养后，发现敲除小鼠的肿瘤生长显著降低。通过IHC和流式分选等实验进一步验证了CD4+ T细胞的免疫抑制功能可能由TCF1介导。上述的实验结果显示出了Tcf7在调控CD4+T细胞改变肿瘤微环境的重要作用。

接下来，作者设计了对应的Tcf7敲除模型小鼠进行单细胞测序。分析结果显示Tcf7在CD4+T细胞中的表达水平最高。为了探索Tcf7失活后T细胞的变化，作者对Cd3e表达细胞进行了亚群再聚类分析，并确定了11个不同的cluster。进一步的比较分析显示了在Tcf7缺失模型组中，Treg细胞显著减少，而Th17细胞显著增加。随后，作者通过实验验证了这一结论，从而，揭示了Tcf7的失活抑制Treg细胞分化，促进Th17细胞分化的作用。

接下来，为了确定CD4+ T细胞中Tcf7的失活是否改变了PDA TME中髓系细胞的组成，作者对髓系细胞进行了亚群再聚类，共鉴定出6种细胞类型，发现不同的细胞在两组模型中的变化显著。然后作者研究了髓系细胞免疫抑制的潜力，然而不同的髓系细胞亚群在两组间的Cd274(PD-L1)表达水平相似，但是Arg1和Nos2的表达水平在敲除组中更高。这些结果提示了敲除Tcf7导致了免疫抑制表型增强。这一结果与作者之前观测到的结果相吻合。随后，作者通过质谱流(CyTOF)技术再次验证了这一结果，同时发现在CyTOF的结果中，Tcf7敲除组的PD-L1的髓系细胞数量增加。因此，作者推测PD-L1+细胞的增加是否可以作为治疗胰腺癌的靶点。

先前的报道显示，在一些肿瘤中存在IL-17与PD-L1的表达相关。因此，作者在骨髓来源的髓系前体细胞(BMDMs)上测试了IL-17是否调节PD-L1的表达。结果发现，IL-17A会导致Cd274、Arg1和Nos2的高表达。然而这一结果却没能在PDA模型的细胞系中重现。随后，作者设计了细胞共培养实验，证实了TCF1缺失的CD4+ T细胞能够诱导肿瘤细胞中PD-L1的表达。

作者先前的数据表明了WNT通路在上皮细胞中参与对肿瘤的支持作用。作者设计使用能够抑制WNT信号通路的PORCN抑制剂(PORCNi)，将小鼠随机分为对照组或PORCNi组。结果发现PORCNi治疗后的小鼠肿瘤更小。然后，作者通过流式细胞术评估了WNT信号的抑制作用是否改变了肿瘤的微环境。结果观察到在PORCNi治疗后的小鼠中Total T细胞和CD8+ T细胞浸润的增加。随后，作者又通过抗CD8和抗PD-L1进行功能验证，发现抑制WNT信号可以使PDA对PD-L1阻断敏感，表明联合靶向可以降低胰腺癌的生长，并可能有益于胰腺癌的治疗。