血液4D-DIA蛋白组项目文章NC（IF 17.69）|西南医院柴进教授团队采用血液蛋白质组学等方法探究原发性胆管炎的致病靶点

对照组和PBC患者肝脏样本和血清样本、小鼠肝脏样本

作者对4名对照组受试者（CTR）和5名PBC患者的肝脏进行了单细胞转录组测序分析（图1a），质控后共获得70,050个肝细胞。UMAP（统一流形逼近与投影）分析显示共鉴定到30个细胞群(图1b)，分为11种细胞类型(图1d)。细胞类型差异分析发现与对照组相比，PBC肝脏中内皮细胞、胆管细胞和间充质细胞的比例减少，而T细胞和浆细胞的比例增加（图1g-1h）。

由于PBC的特点是选择性破坏小BECs，作者进一步分析了胆管细胞。结果发现胆管细胞共分为8个簇(图2a-2b)，其中胆管细胞簇（3）仅在对照组中被检测到，而未在PBC肝脏中检测到（图2c-2d）。此外，胆管细胞簇（3）的双氧化酶2 (DUOX2)和血管紧张素转换酶2 (ACE2)呈现高表达的状态（在其他胆管细胞簇中表达非常低）（图2e-2f），这表明人类肝脏中有一个独特的胆管细胞亚群是PBC的潜在靶点。接下来，作者通过流式细胞分选、RNAscope、qPCR等方法证实肝细胞高表达CK19、DUOX2和ACE2，且高表达胆管细胞特异性标记物、高表达小胆管细胞的标记基因（图2g-2j），故作者将胆管细胞簇（3）定义为DUOX2⁺ACE2⁺胆管细胞。

KEGG通路分析发现与其他胆管细胞簇相比，DUOX2⁺ACE2⁺小胆管细胞中胆汁分泌通路显著富集(图3a)。且肝脏切片RNAscope和多重IF分析显示，与对照组相比，PBC患者小胆管中DUOX2⁺ACE2⁺小胆管细胞的数量显著减少(图3b-e)。此外，DUOX2⁺ACE2⁺小胆管细胞数量的减少与PBC的严重程度显著相关（图3f）。另外，在AMA-M2阳性或AMA-M2阴性的PBC患者中，肝脏DUOX2⁺ACE2⁺小胆管细胞数量显著减少，但在阻塞性胆汁淤积症(OC)、继发性硬化性胆管炎(SSC)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者中则没有(图3g)。综上所述，PBC中肝脏DUOX2⁺ACE2⁺小胆管细胞数量显著减少与胆汁分泌障碍和PBC严重程度密切相关。

众所周知，PBC是由自身免疫介导的胆道损伤引起的。为了研究哪些免疫细胞浸润与DUOX2⁺ACE2⁺小胆管细胞损伤有关，作者使用苏木精-伊红(HE)(图4a)、空间转录组学(ST)(图4b-e)和多重IF分析(图4f)对照组和PBC患者的冷冻肝脏切片进行分析。 结果发现与对照组相比，PBC肝切片中B细胞、浆细胞和T细胞比例增加（图4c），PBC肝门静脉区位置B细胞和浆细胞浸润明显增加、单核细胞和NK细胞比例明显降低(图4d-4e)、DUOX2⁺ACE2⁺小胆管细胞数量显著减少而B细胞和浆细胞数量显著增加（图4f）、CD27+记忆B细胞数量显著增加（图4f）。此外，与对照组相比，PBC患者的浆细胞克隆扩增增加(图4g)。接下来，作者使用CellPhoneDB分析了DUOX2⁺ACE2⁺小胆管细胞与免疫细胞之间的潜在相互作用。结果显示配体与DUOX2⁺ACE2⁺小胆管细胞和免疫细胞表达的受体之间存在显著的相互作用(图5a-c)。综上所述，PBC发病过程中，免疫应答与肝脏DUOX2⁺ACE2⁺小胆管细胞数量的选择性减少有关，也可能通过细胞-细胞相互作用影响其他类型的胆管细胞。

为了研究浆细胞产生的自身抗体与肝脏DUOX2⁺ACE2⁺小胆管细胞损伤的关系，作者对对照组和PBC患者的血清样本进行4D-DIA蛋白质组学分析（未去除血清高丰度蛋白） (图6a-6b)。血清蛋白质组学共定量到2805个蛋白，其中50个蛋白显著上调、87个蛋白显著下调（PBS/TCR）(图6c)。显著差异分析和火山图结果显示PBC患者血清pIgR水平明显高于对照组（图6d-6e）, PBC患者血清抗pIgR抗体水平也显著升高(图6f)。对人类和/或小鼠肝细胞的进一步分析显示，在DUOX2⁺ACE2⁺小胆管细胞中，pIgR mRNA转录物和蛋白质的水平明显高于DUOX2^-ACE2^-胆管细胞和其他类型的肝细胞(图6h-j)。另外，在对照组肝脏中，pIgR蛋白主要在DUOX2⁺ACE2⁺小胆管细胞中检测到，而在PBC肝脏中，pIgR蛋白的表达明显降低 (图6k)。综上所述，在人类PBC的致病过程中，pIgR特异性自身抗体可能与DUOX2⁺ACE2⁺小胆管细胞损伤有关。