项目文章GB（IF18）| 4D-DIA蛋白组等多组学助力中科院脑智卓越中心揭示小鼠胚胎母源-合子转换过程中的RNA m6A动态
2023-04-27
中科新生命
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母源-合子转化(MZT)是卵母细胞由母源环境向合子基因组驱动的表达程序转变的一个基本而保守的过程，这一过程将最终分化的卵母细胞和精子重新编程为全能性状态。MZT是由母体mRNA和蛋白质启动，随后逐渐转为合子基因组激活（ZGA），并伴随着母源RNA和蛋白质的清除。胚胎发育的一个关键问题是MZT如何被调节。然而，尽管母体沉积的快速清除的mRNA和新合成的合子RNA产物在推动早期胚胎发生方面具有重要意义，但RNA控制的各种机制仍然知之甚少。N6-甲基腺苷(m6A)是高等真核生物信使RNA (mRNA)中最常见的内部修饰，在细胞命运维持和转变过程中发挥重要作用。但是m6A修饰对MZT过程中RNA代谢的潜在调节作用尚不清楚。
2023年4月，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）刘真研究组、孙怡迪研究组与上海交通大学医学院公共卫生学院单细胞组学与疾病研究中心李辰研究组合作在Genome Biology（IF 17.906）期刊发表了题为“Reading and writing of mRNA m6A modification orchestratematernal-to-zygotic transition in mice”的研究论文。该研究利用SLIM-seq技术绘制出小鼠胚胎母源-合子转换过程中RNA m6A修饰动态图谱，并通过蛋白质组学分析和CRISPR/Cas13d介导基因敲低揭示m6A的读写对于小鼠着床前胚胎发育的影响。中科新生命为研究提供4D-DIA蛋白质组学技术支持。
研究材料
小鼠的MII卵母细胞、晚期1细胞胚胎(L1C)、晚期2细胞胚胎(L2C)
技术路线
步骤1：MZT期间m6A标记mRNA的动态图谱分析；
步骤2：m6A修饰功能分析：促进RNA衰变，亦可维持RNA稳定；
步骤3： m6A修饰通过维持mRNA的稳定性调控MZT；
步骤4：Ythdc1结合m6A修饰的mRNA并调控其稳定性。
研究内容
1. MZT期间m6A标记mRNA的动态图谱分析
为了揭示MZT期间m6A的动态图谱，作者对小鼠的MII卵母细胞、晚期1细胞(L1C)和晚期2细胞(L2C)胚胎进行SLIM-seq（微量样本m6A测序技术）分析(图1a)。SLIM-seq中共鉴定到3396个m6A标记的mRNAs和973个m6A标记的ncRNAs（图1b）。与RNA-seq对比分析发现m6A标记的mRNA数量在受精后显著减少，而在合子基因组激活(ZGA)期间增加，在不同阶段，m6A水平的变化与m6A标记mRNA数量的变化相同，揭示了早期胚胎发育过程中m6A动态的三种主要模式：母体丢失、一致遗传和新生获得(图1c-1e)。综上所述，小鼠MZT期间m6A标记的mRNA呈现高度动态变化。
2. m6A修饰功能分析：促进RNA衰变，亦可维持RNA稳定
卵母细胞的成熟和受精均伴随RNA的降解，之前的研究表明m6A结合蛋白Ythdf2在母体RNA衰变中发挥重要作用。m6A是否参与了受精后RNA的降解仍未知。SLIM-seq分析发现982个m6A标记的基因在MII卵母细胞中特异性富集而在受精后丢失,且近半的标记基因其mRNA表达水平下降，表明m6A对这些mRNA具有促衰变作用。1243个基因从L1C到L2C中被m6A新标记，即在是受精后重新产生，且近半新标记的基因的mRNA表达水平增加。另外发现609个m6A标记基因一致地从MII卵母细胞遗传到L2C胚胎,其mRNA水平上亦没有变化（图1f-1g）。综上所述，除了促进RNA衰变外，m6A修饰还参与维持RNA的稳定性。
图1 小鼠MZT期间m6A动态图谱分析和功能分析
3. m6A修饰通过维持mRNA的稳定性调控MZT
由于m6A修饰的基因是遗传的，故作者推测这些mRNA是为了促进翻译而维持的，并与哈佛大学张毅团队发表的同时期LiRibo-seq翻译图谱进行比对分析。结果显示，在609个m6A标记基因中，LiRibo-seq数据中可检测到559个(图2a)，且其中大多数基因在L1C和L2C阶段翻译水平升高，表明母系遗传的m6A标记mRNA在此阶段进行了翻译（图2b）。随后作者采用4D-DIA蛋白质组学的方法进一步验证，每个蛋白质组样品仅使用20个小鼠卵母细胞或胚胎细胞，共检测到5328个基因编码的5353种蛋白质。其中LiRibo-seq数据中可检测到的559个基因中有333个基因在蛋白质组学中亦检测到了。聚类分析发现在MZT期间，大多数基因的表达水平保持或增加。GO分析结果显示，这些基因显著富集在mRNA和蛋白酶体调控中(图2c-2h)。综上，母系遗传的m6A标记的mRNA通过维持稳定性用于翻译，进而调控MZT。
4. Ythdc1结合m6A修饰的mRNA并调控其稳定性
mRNA的m6A修饰受多方面的调控：甲基转移酶、脱甲基酶和 m6A结合蛋白，它们在早期胚胎发育的不同阶段发挥不同的作用。为了探究这些蛋白质对mRNA功能的影响，作者采用CRISPR/Cas13d技术同时敲低小鼠受精卵中m6A的调控因子Ythdc1和Ythdf2，发现可以显著影响小鼠着床前胚胎发育（图2i）。为进一步研究Ythdc1对m6A标记的mRNA的影响，敲低Ythdc1的胚胎进行了转录组测序和RNA免疫沉淀(RIP)-qPCR等实验，结果表明Ythdc1可以结合一些母源携带m6A的转录本，并参与其RNA稳定性调控(图2j-2o）。
图2 母系遗传的m6A修饰维持mRNA的稳定性并与蛋白质翻译有关
小结
该研究揭示了小鼠MZT过程中的m6A修饰的动态变化，鉴定了少量参与着床前胚胎发育的m6A调控分子，初步阐明了Ythdc1可能参与母源继承m6A转录本的稳定性调控，体现了多组学分析在胚胎发育研究中的重要性。
阅读原文
https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-023-02918-9
参考文献
Yin et al., Cell Stem Cell, 2021
Zhang et al., Sci Adv. 2022
Gu et al., bioRxiv, 2023
Kushawah et al., Dev Cell, 2020
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