中科项目文章 | 蛋白质组学(iTRAQ+PRM)探讨药物联合治疗胃癌细胞效果和作用机制

iTRAQ‑based proteomics analysis of the therapeutic effects of combined anticancer bioactive peptides and oxaliplatin on gastric cancer cells

Oncology Reports     IF=3.04

研究背景

胃癌（Gastric Cancer, GC）是最常见的癌症类型之一，也是全球癌症死亡的第二大原因。胃癌的病因复杂，确切发病机制尚不清楚，由于缺乏有效的临床早期诊断和治疗的肿瘤分子标志物，大多数胃癌患者确诊时已是中晚期，故而导致疗效不佳，死亡率高居不下，患者的5年生存率仅有25％左右。此外，这些患者有很高的局部复发和远处转移的风险，预后差，存活率低。因此，胃癌与疾病负担显著相关。

奥沙利铂（Oxaliplatin，OXA)是第三代铂类抗肿瘤药物，以DNA为靶作用部位，铂原子与DNA形成交叉联结，拮抗其复制和转录。广泛的应用于胃肠道恶性肿瘤的临床治疗。然而，OXA作为一种化疗药物，使用起来存在一些缺点，长期使用可降低OXA最初的治疗效果，通过提高副作用的风险以及多药物抗性，因此，寻找针对胃癌的新的组合治疗方法成为了研究热点。

抗肿瘤生物活性多肽（ACBP）是用人胃癌细胞免疫山羊，从羊肝脏中分离获得，含有多种肽段，分子量8kDa，包括泛素蛋白酶和脂肪酸结合蛋白。ACBP不干扰体内正常的生理功能和酶反应。此前的研究也表明，ACBP具有有效的抑制包括胃癌细胞、鼻咽癌细胞和胆囊癌细胞等多种肿瘤细胞的增殖，具有诱导肿瘤细胞凋亡以及调节患者机体无氧糖代谢等作用。

联合ACBP和低剂量的顺铂可获得与高剂量顺铂治疗同样的治疗效果，有效的降低了顺铂剂量和可能的药物抗性。然而，ACBP联合OXA抑制增殖，包括凋亡、引起不可逆的MKN-45细胞停滞在细胞周期的G2/M时期。另外，ACBP-OXA可显著提高生产率和抑制体内肿瘤形成能力。因此，ACBP-OXA可作为新的胃癌治疗策略。但是，ACBP-OXA治疗胃癌效果的具体机制仍不清楚。

来自内蒙古医科大学团队通过iTRAQ蛋白质组学技术，探讨了ACBP-OXA联合对MKN-45细胞的治疗作用及其作用机制。相关研究成果以题为“iTRAQ‑based proteomics analysis of the therapeutic effects of combined anticancer bioactive peptides and oxaliplatin on gastric cancer cells“ 发表在2019年的Oncology Reports期刊上。中科新生命参与了iTRAQ定量蛋白组学检测分析以及靶向蛋白PRM验证工作。

研究材料

研究人员选用MKN-45细胞（人胃癌细胞），实验设计4个组，分别是对照、ACBP处理组、AOX处理组和ACBP-OXA联合处理组。

技术路线

图1. 研究技术路

研究结果

1. 蛋白组学分析筛选差异蛋白

首先对4组细胞样本进行iTRAQ蛋白质组学分析，一共鉴定到6210个蛋白质。随后通过变化倍数（Fold change, FC）≥1.2或者≤0.833，且P≤0.05的标准对不同的比较组进行差异蛋白筛选。从3个不同的比较组一共筛选出256个差异蛋白。其中与单独使用ACBP或者AOX处理组与对照组相比，ACBP-AOX联合使用获得的差异蛋白最多，这些差异变化的蛋白作者认为可作为重要的生物标志物评估ACBP-OXA治疗胃癌效果。

2. 差异蛋白功能及通路分析

作者进一步对差异蛋白的功能进行分析。结果显示，OXA处理组与对照组比较筛选到的差异蛋白主要与细胞核、细胞质以及结构分子活性有关。ACBP-OXA处理组与对照组比较筛选的差异蛋白主要定位于细胞核、膜附着腔、细胞器，参与催化活性和结构分子活性，影响信号转导，细胞组分组织或者生物发生、生物学过程负调控，表明两种药物联合使用对胃癌细胞治疗发挥互补和协同的治疗作用。

图2. ACBP-OXA处理组差异蛋白GO功能分析

随后作者对差异蛋白进行KEGG分析分析，结果显示，ACBP处理在差异蛋白主要参与糖基化生物合成、类固醇激素合成、矿质元素吸收和细胞周期等通路。OXA处理差异蛋白主要参与肿瘤相关信号通路、黏附、转录错误调控、RNA转录、ECM受体激活和PI3-AKT信号通路。ACBP-OX处理组差异蛋白主要参与核糖体、肿瘤相关信号通路、趋化因子、PPAR和AMPK等通路。

图3. ACBP-OXA处理组差异蛋白KEGG分析

3. 重点蛋白靶向验证

最后研究人员通过平行反应监测技术（PRM）对其中6个蛋白（TPX2, NUSAP1, TOP2A, YAP, MKi‑67 和GPC4）进行验证。结果与蛋白质学结果一致。

小结

作者通过iTRAQ定量蛋白质组学技术以及PRM技术从蛋白质组学的角度阐述、评估了ACBP-OXA对于MKN-45细胞的作用，从中发现有6个蛋白（TPX2、NUSAP1、 TOP2A、YAP、MKi‑67 和 GPC4）在ACBP-OXA后表达水平显著的降低，通路分析表明AMPK信号通路可能是ACBP-OXA抑制MKN-45胃癌细胞其中一条重要的通路。该研究结果可能为将来胃癌治疗策略提供指导意义，也为ACBP联合OXA治疗胃癌提供新的见解。

原文链接：https://doi.org/10.3892/or.2019.7406