硫酸吲哚酚作用：SiRNA沉默对动脉粥样硬化的影响
2020-02-14
中科新生命
2503人口老龄化和糖尿病的增多，导致慢病肾脏病（CKD）大规模流行，已成为全球最大的健康威胁之一；我国CKD的发病率高达10.8%（约1.3亿），其中近3000万患者将发展成终末期肾脏病。近年来研究发现，CKD会增加心血管疾病（CVD）的发病率和死亡风险。CKD患者中，冠状动脉疾病、外周动脉疾病和中风在内的动脉粥样硬化（AS）类疾病风险较高，但传统CVD危险因素（高血压、糖尿病、血脂异常等）无法解释其原因。
Uremic Toxin Indoxyl Sulfate Promotes Pro-Inflammatory Macrophage Activation Via The Interplay of OATP2B1 and Dll4-Notch Signaling. 2019年，来自哈佛大学医学院的研究团队在心血管顶刊Circulation （IF=23.054）上在线发表“Uremic Toxin Indoxyl Sulfate Promotes Pro-Inflammatory Macrophage Activation Via The Interplay of OATP2B1 and Dll4-Notch Signaling”的研究成果，揭示了CKD引起AS的潜在新机制。 01 相关背景知识简述 ◆ AS过程以炎性巨噬细胞激活为特征 ◆ 硫酸吲哚酚硫酸盐（一种色氨酸代谢的尿毒症毒素）是CKD心血管疾病发病率和死亡率的独立危险因素（具体机制，未知） ◆ 肾小管上皮中，硫酸吲哚酚通过有机阴离子转运蛋白（OAT）和有机因子转运肽（OATP）从血液排至尿液（但是否存在巨噬细胞，未知） ◆ 硫酸吲哚酚可诱导内皮细胞促炎反应（但是否作用巨噬细胞，未知） 02 技术路线图 03 研究结果 表型验证：硫酸吲哚酚可诱导人原代巨噬细胞（PBMC）促炎因子分化 为验证硫酸吲哚酚促进血管炎症的假设，作者首先检测了硫酸吲哚酚处理后的PBMC中促炎因子（IL-1β、TNF-α、MCP-1）和抗炎因子（MRC1、AMAC1、IL-10、CD163）转录水平变化。发现硫酸吲哚酚以剂量依赖性诱导促炎因子表达，并在4%白蛋白培养基（模拟人类血清）培养的PBMC中得到证实，而硫酸吲哚酚来源的色氨酸无上述激活作用（图1）。 机制探索（1）：探究巨噬细胞对硫酸吲哚酚的诱导响应机制 a. 对文献报道进行验证 作者首先检测了PBMC中OAT和OATP表达（由SLCO超家族基因编码），并通过SiRNA沉默策略证实SLCO2B1/3A1/4A1可影响PBMC中吲哚酚硫酸盐对IL-1β和MCP-1诱导；并通过小鼠腹腔巨噬细胞进行同样实验，结合临床OATP抑制剂（丙磺舒、利福平和环胞霉素A）处理PBMC等实验证实SLCO2B1的基因产物（OATP2B1）介导了吲哚酚硫酸盐的摄取，促进PBMC促炎性激活（图2）。 b. 发现新机制（核心结果） 作者采用TMT蛋白组学策略，对吲哚酚硫酸盐处理不同时间的巨噬细胞系（RAW264.7）进行分析，共发现4178个蛋白。作者进一步对定量到的蛋白质表达量进行聚类，并与疾病表型进行互作网络分析，从中发现6个早期互作网络。其中Notch信号通路变化最为显著（图3）。 作者进一步检测PBMC中Notch信号同理成分表达及信号通路激活情况。作者通过PCR、WB、流式细胞术和免疫荧光等实验证实。硫酸吲哚酚处理后，可在30分钟内迅速增加D114蛋白，且在3小时增加Notch1累积（图4）。 机制探索（2）：硫酸吲哚酚作用机制（OATP2B1-USP5-D114-Notch信号） a. 作者通过γ-分泌酶抑制剂DAPT（泛Notch信号抑制剂）干预，发现其可抑制吲哚酸硫酸盐对PBMC中IL-1β、TNF-α和MCP-1的诱导（图5）。 b. 进一步进行D114 SiRNA和中和抗体干预实验，发现干预后可降低PBMC中吲哚酸硫酸盐的诱导作用（图6）。 c. 接着，作者发现利用SiRNA策略沉默SLCO2B1（OATP2B1），可抑制吲哚酚硫酸盐处理后PBMC中对D114蛋白表达和Notch靶基因Hes1转录的诱导（图7）。 d.作者发现，吲哚酸硫酸盐处理后，可迅速增加D114蛋白水平表达，而且mRNA水平无变化（图8-1）。因此，作者提出假设：吲哚酚硫酸盐通过抑制泛素蛋白酶体途径抑制D114降解。作者重新分析了蛋白组学数据，并结合实验证实硫酸吲哚酚可通过抑制泛素蛋白酶体途径，增加去泛素酶USP5并抑制D114蛋白降解（图8-2）。 转化潜能：阻断D114可减弱CKD小鼠动脉粥样硬化进展 作者首先检测了CKD小鼠中Notch信号激活情况，通过免疫荧光染色证明AS病变部位中更多巨噬细胞表达D114，从而进一步引起Notch信号激活。进一步在模型中给予D114中和抗体，发现可以减轻CKD小鼠的AS疾病进展，并减轻炎症反应（巨噬细胞累积）（图9）。 04 小结 本研究深入解析了硫酸吲哚酚诱导人原代巨噬细胞炎性激活、并加速动脉粥样硬化的病理机制。作者通过TMT蛋白组学技术，结合深度生信分析找到硫酸吲哚酚下游关键信号通路（Notch），并围绕Notch激活机制及下游信号通路展开体内外实验反复论证，阐明CKD引起动脉粥样硬化疾病的关键机制（OATP2B1-USP5-D114-Notch）。此外，作者还针对其中关键靶点D114蛋白，从SiRNA、中和抗体两个层面证实干预后可缓解CKD小鼠动脉粥样硬化进展及其炎症激活。并在最终在利用巨噬细胞靶向的脂质纳米颗粒包裹SiRNA，在动物体内实验对CKD小鼠AS类疾病的外源性干预，为临床药物靶点研发和诊疗提供了理论基础。
