Cancer Res: 斯坦福研究团队探究小细胞肺癌的脂质代谢调控机制

小细胞肺癌（SCLC）是肺癌的一个亚型，其特点是诊断晚、转移快、生存率很低。全世界每年有20多万患者死于SCLC。随着世界上吸烟率的增加，SCLC患者的数量持续增长。SCLC患者通常采用放化疗联合治疗。然而，肿瘤耐药性通常在数月内出现，此时，治疗选择少且无效，导致这种疾病的生存率很低，目前对SCLC基本生物学知识缺乏了解。亟需对SCLC生物学特性和其致瘤性的潜在途径进行更深入的了解，对研发新的、靶向的系统治疗方案至关重要。

2020年, 来自斯坦福大学的研究团队在Cancer Res期刊发表了题为"The MEK5-ERK5 kinase axis controls lipid metabolism in small cell lung"的研究成果。研究人员在小鼠和人源SCLC细胞中，采用RNAi干扰技术沉默MEK5-ERK5激酶轴表达，通过应用转录组学+脂质组学技术联合探讨MEK5和ERK5在SCLC中分子作用机制。

The MEK5-ERK5 kinase axis controls lipid metabolism in small cell lung.

Cancer Res：IF=8.378

Jan 22, 2020; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-19-1027. 

研究材料

实验组：小鼠细胞：mSCLC KP1；人细胞：hSCLC NJH29；人和小鼠SCLC细胞中干扰MEK5基因（shMEK5）和ERK5基因（shERK5）。

对照组：shCTRL和shGFP；药物：阿托伐他汀钙。

技术方法

反相蛋白阵列技术、转录组学、脂质组学

研究路线

研究结果

1. 关键基因锁定——提出科学问题

从癌症依赖地图网站(depmap.org/portal/download/)中获取RNAi Cancer Dependency Map数据，对25个SCLC细胞株数据分析显示SCLC对MAP2K5基因具有依赖性，MAP2K5是MEK5的编码基因。编码ERK5的MAPK7在SCLC细胞系不具有依赖性，推测在SCLC细胞中可能存在额外的靶点或ERK5的损失更容易补偿。结合相关文献，推测这两种激酶MEK5和ERK5在肺癌中扮演非常重要的作用。

2. 功能验证：MEK5和ERK5基因沉默抑制了SCLC细胞增殖

通过shRNA干涉小鼠和人SCLC细胞中MEK5和ERK5表达水平。当MEK5-ERK5轴被沉默时，与对照shRNAs细胞相比， hSCLC NJH29细胞和mSCLCKP1细胞生长速度相对缓慢（图1A-B）。通过NSG小鼠皮下肿瘤生长试验，发现与对照相比， MEK5或ERK5沉默细胞导致肿瘤体积减小（图1C-D）。结果表明MEK5和ERK5激酶有助于SCLC细胞在体外和体内的增殖。

为了进一步研究该激酶不同结构域对细胞增殖的作用，突变ERK5激酶的不同结构域，发现野生型和反激酶域突变体可解除ERK5沉默后对细胞生长抑制，而ERK5激酶域突变体未能解除对ERK5沉默细胞的生长抑制，上述结果进一步证明ERK5激酶活性对SCLC细胞的最佳生长具有非常重要的意义。

图1. MEK5和ERK5基因沉默抑制SCLC细胞的扩增

3. 反相蛋白阵列技术(RPPA)分析：MEK5和ERK5基因沉默并诱导SCLC细胞死亡

在前期表型数据的基础上，为了探究表型变化背后分子调控信号网络，采用反相蛋白阵列技术进行组学分析。通过无监督聚类分析发现：MEK5和ERK5沉默细胞聚集在一起，表明MEK5和ERK5在SCLC细胞中属于相同的磷酸级联（图2A），分析发现当MEK5和ERK5沉默后，凋亡细胞死亡通路中涉及的蛋白质如裂解Caspase 7、裂解PARP和促凋亡因子BIM含量增加。与细胞培养结果一致：MEK5和ERK5基因沉默细胞在培养中表现出更高的细胞凋亡倾向（图2B-C），细胞周期并没有明显变化。在shERK5— NJH29细胞异种移植的小鼠模型中发现细胞周期标志物PCNA含量没有明显改变，细胞凋亡标志物PARP和cleaved Caspase 3表达增加（图2D-F），这些结果进一步表明，MEK5-ERK5轴主要通过促进SCLC细胞的存活来控制SCLC细胞的增殖。

图2.MEK5和ERK5沉默在SCLC细胞群中诱导细胞死亡

4. 转录组学分析：MEK5或ERK5降低会扰乱了与代谢途径相关的基因编程

通过无监督分层聚类分析发现MEK5和ERK5沉默后mSCLC KP1细胞与对照细胞分开聚集（图3A）；同样，MEK5沉默后hSCLC NJH29细胞与对照细胞分开聚集，并且两者差异基因表达在KP1细胞中有明显的重叠，证实了这两种激酶确实在同一磷酸级联中起作用（图3B），基因富集分析表明，MEK5和ERK5水平降低时，代谢途径下调（图3C）。前面癌症依赖图网站获取25个SCLC细胞株数据基因功能分析发现，证实了MEK5-ERK5信号与丙酮酸代谢、乙醛酸和二元酸代谢以及柠檬酸循环和糖酵解有关（图3D）。

转录组数据锁定到一个重要的转录因子靶基因：固醇调节元件结合蛋白（SREBP）靶基因SREBP靶点，在MEK5沉默的人和鼠细胞以及ERK5沉默的小鼠鼠细胞中下调（图4A）。SREBP途径有两个分支，包括SREBF2调节的甲戊酸途径（导致胆固醇合成）和SREBF1调节的脂肪酸合成途径。上述结果表明许多发生改变的基因和通路与脂质代谢相关，包括与胆固醇稳态和从头合成脂肪酸（FA）有关的途径。推测MEK5-ERK5模块失活后，代谢的改变，包括脂质代谢，可能有助于降低细胞存活率和抑制细胞生长。

图3.MEK5和ERK5沉默后干扰SCLC细胞的代谢途径

5. 脂质组学分析，MEK5和ERK5基因沉默影响胆固醇合成途径

为进一步研究SCLC中脂质代谢以及MEK5ERK5轴与脂质内稳态之间的联系，采用脂质组学方法检测脂质分子的表达变化。CE (胆甾醇酯)、DCER (二氢神经酰胺)或DAG (二酰甘油)脂质种类发生显著改变，CEs和DAG是ERK5基因沉默细胞中主要下调的脂质类。在MEK5-ERK5沉默细胞中游离脂肪酸（FFAs）没有明显的改变；不同种类的三酰甘油（TAG）的相对丰度发生了变化（图4B），这些数据共同指向MEK5-ERK5下游的胆固醇生物合成途径，并提示这些代谢缺陷可能导致了MEK5或ERK5沉默时SCLC细胞活性的丧失。

图4. MEK5和ERK5的缺失改变了SCLC细胞的脂质组学特征

6. 脂质组转录联合锁定关键通路：甲羟戊酸途径

转录组学、脂质组学数据锁定到关键通路：甲羟戊酸途径；该途径由一系列酶促反应组成，这些酶促反应将乙酰辅酶转化为胆固醇和异戊二烯。在转录组数据中，shMEK5和shERK5的人和小鼠SCLC细胞中，参与该途径不同反应中编码酶的基因被下调（图5A），与脂质组学分析结果一致。

图5 A. MEK5和ERK5基因沉默可抑制甲羟戊酸途径，增加对甲羟戊酸途径抑制剂的敏感性

7. 功能验证：抑制MEK5-ERK5轴和甲羟戊酸途径均能抑制SCLC细胞的增殖

为了评价甲羟戊酸途径在SCLC中重要性，采用甲羟戊酸途径限速酶HMG-CoA还原酶（HMGCR）的抑制剂阿托伐他汀钙处理人SCLC细胞株和存活小鼠KP1细胞，治疗2天后，人SCLC细胞株和存活小鼠KP1细胞的存活率分别平均下降50%和60%，第5天的存活率下降约80%（图5C）。我们的研究中NJH29细胞系是对阿托伐他汀治疗最耐药的细胞系之一。值得注意的是，NJH29细胞中ERK5的缺失使这些细胞进一步对低剂量阿托伐他汀抑制甲羟戊酸途径敏感（图5D）。

图5. MEK5和ERK5基因沉默可抑制甲羟戊酸途径，增加对甲羟戊酸途径抑制剂的敏感性

小结

该研究是利用多组学联合（蛋白组、转录、脂质组学）策略，首次提出了MAP激酶途径中一个研究较少的分支——MEK5/ERK5双激酶轴——对于维持SCLC细胞活力至关重要。此外，还确定了先前未知的SCLC细胞中MEK5-ERK5轴与下游胆固醇生物合成，特别是甲羟戊酸途径的联系。同时抑制两种途径对SCLC细胞增殖的影响可能大于抑制每一种途径的可能性。抑制MEK5/ERK5轴可以增强抑制甲羟戊酸途径的抗癌作用，因此，MEK5-ERK5激酶有效和特异性抑制剂的开发，有望实现抗肿瘤作用。此外，甲羟戊酸途径抑制剂具有疫苗佐剂活性，并通过增强抗原呈递细胞的功能与抗PD-1抗体协同作用杀死肿瘤细胞，可能作为SCLC疫苗的未来佐剂，与FDA批准的免疫疗法一起使用以实现SCLC免疫治疗的新方案。

小编心得（必看）：

本文是揭示疾病背后复杂生物学调控机制，寻找治疗靶点的代表性文章，主要思路：“公共数据重分析锁定目标分子 →功能研究（细胞＆动物：RNAi干扰确定目标分子对疾病的影响） → 多组学联合，筛选关键调控通路及靶标分子→ 功能验证（细胞＆动物：抑制剂干预靶标分子，评估治疗效果）”在医学基础研究中非常值得借鉴和参考！