蛋白质组学分析：肿瘤细胞外囊泡（EVs）亚群的分离

细胞外囊泡（EVs）是一种新发现的细胞间通讯器，可以激活细胞表面的受体或将其货物（例如蛋白质、核酸和脂质）转移到细胞中，从而导致受体细胞表型改变。根据生物发生和特征不同，EVs分为两种亚型：微囊泡和外泌体。微囊泡直径约100-1000 nm，通过质膜出芽释放，而外泌体直径约30-200 nm，通过内体途径形成多囊泡体而释放。然而，这种二分法受到最近发现的几个EVs亚群的挑战，表明EVs的复杂性比以前认为的要大。迄今为止，大多数细胞外囊泡（EVs）研究都是在细胞系上进行的，但对这些细胞在体内如何表现出EVs的特性知之甚少。

瑞典哥德堡大学医学院于2020年在《J Extracell Vesicles》（IF=11）上发表了论文“Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation”。该研究建立了一种直接从肿瘤组织中分离并分类出EVs亚群的方法，并进一步通过定量蛋白质组学鉴定EVs亚群。

J Extracell Vesicles  IF=11

DOI：10.1080/20013078.2020.1722433

研究材料

27例确诊为III或IV期转移性恶性黑色素瘤的患者的肿瘤组织（包括中途转移、淋巴结转移、肠转移和肝转移），用于EVs分离的肿瘤的大小为0.02–15.5 g，3次生物学重复。

技术方法

TMT定量蛋白质组学

研究路线

研究结果

1. 分离方法建立——获得更多种类的EVs

该方法重要的原因在于：1）细胞系培养物缺乏肿瘤微环境的复杂性，其中肿瘤细胞、结构细胞和免疫细胞都在相互作用；2）与肿瘤细胞来源的EVs相比，肿瘤组织来源的EVs可提供更多信息，因为细胞系可能无法很好地代表肿瘤；3）可以从体液中分离出肿瘤EVs，但是它们会与其他细胞和器官来源的EVs混合在一起。为了解决这些问题，作者开发了新方法用以获得更多EVs亚群。

（1）发现EVs：黑色素瘤组织的细胞组成以及肿瘤间质空间中存在EVs

首先，作者确定了转移性黑色素瘤组织的细胞组成。如组织学检查所示，肿瘤组织坏死面积较小，但主要由非典型纺锤形黑素细胞组成（图1 a）。常规的黑色素瘤标志物免疫组化染色显示，S-100蛋白和SOX-10的表达高于Melan-A和GP100（图1 b-f），这与以前的观察结果一致。

图1 免疫组织化学分析显示，在转移性黑色素瘤中S-100和SOX10呈阳性

然后，通过流式细胞确定，大多数肿瘤具有3个不同的细胞群（图2 a）。在淋巴结转移中，淋巴细胞（CD45+ CD3+）是最丰富的细胞类型，而在皮肤转移中，小的非淋巴样免疫细胞（CD45+ CD3-，可能是中性粒细胞）最丰富（图2 b, d）。大型颗粒细胞在淋巴结转移和皮肤转移中都很常见（图2 c）。这些大型细胞大多数是CD45-，因此很可能是肿瘤细胞。还有一些细胞是CD45+ CD3-，它们可能代表巨噬细胞。快速血液涂片染色证实了单细胞悬液中存在中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞（图2 e-f）。

图2 流式细胞仪分析肿瘤组织的细胞组成

接下来，作者通过电子显微镜确定了黑色素瘤转移性微环境中囊泡的存在（图3 a, b）。

图3 转移性黑色素瘤组织中细胞外囊泡的电子显微镜分析

（2）分离EVs亚群：分离方法的建立及其表征

作者通过酶处理、基于差异超速离心的方法开发了直接从肿瘤组织分离EVs的方法，获得2种EVs亚群：大型EVs和小型EVs（图4）。

图4 基于离心的方法从转移性黑色素瘤组织中分离囊泡的示意图

进一步通过透射电子显微镜（图5 a, b）、高分辨率电泳（图5 c）、NTA（图5 d）、ExoViewTM分析（图5 e）、Western blot（图5 f）和ELISA（图5 g）对2种EVs亚群进行可视化和表征，结果共同表明，可以直接从肿瘤组织中分离出EVs。

图5 从转移性黑色素瘤组织中分离出的大型和小型EVs的特性

（3）进一步分离EVs亚群：根据密度识别EVs的亚群

为了进一步分离EVs亚群，作者根据密度梯度进一步将大型和小型EVs分为LD（低密度）和HD（高密度）EVs，获得4个新亚群（图6 a），再次通过透射电子显微镜（图6 b, c）、NTA（图6 d）、高分辨率电泳（图6 e）、和ExoViewTM分析（图6 f）进行可视化和表征。

图6 从转移性黑色素瘤组织中分离出的HD EVs和LD EVs的特性

2. 蛋白质组学——鉴定EVs亚群

（1）蛋白质组学助力：揭示肿瘤组织源性EVs亚群中差异表达的蛋白质

接下来，作者对分离出的6种类型的EVs样品进行了定量蛋白质组学分析——大型EVs、小型EVs、大型HD EVs、大型LD EVs、小型HD EVs和小型LD EVs。通过TMT蛋白质组学总共鉴定出6870个蛋白质，定量了6832个蛋白质。为了可视化不同类型的EVs之间的关系，进行了包括所有定量蛋白质在内的主成分分析（PCA）（图7 a），结果表明与相同大小的EVs相比，密度相似的EVs的亚群蛋白质组更加相似。

多组比较显示，样品中有742种蛋白质差异表达（p值=0.001，q值=0.009211），并且在进行无监督的层次聚类时，这些蛋白质被分为6个大簇。簇1和簇2包含的蛋白质主要在小型LD EVs中富集，而在大型LD EVs中较少。簇1和簇2中的大多数蛋白质是膜蛋白，并且与GO术语“细胞外囊泡”、“血浆膜”、“内体”/“回收内体”和“高尔基体”相关（图7 b, c）。相反，簇3、4和5包含的蛋白质在一些大型EVs样品中富集，并且这些蛋白质与连接到“内质网”或“线粒体”的GO术语相关（图7 d-f）。簇6是唯一包含在小型EVs和小型HD EVs中均富集的蛋白质的簇，该簇包含与“细胞溶胶”、“蛋白酶体”和“核质”相关的蛋白质（图7 g）。

图7转移性黑色素瘤组织中EVs亚群的定量蛋白质组学分析

（2）鉴定EVs亚群标志物：肿瘤组织来源的EVs中存在经典的EVs标志物

接下来，作者构建了与EVs相关的常见蛋白质列表，并进行了多组比较，结果显示在前面获得的蛋白质组数据集中差异表达了这些蛋白质中的64种（p值=0.01，q值=0.020877），并且在无监督的层次聚类下，这64种蛋白质被分为5个簇（图8 a）：簇1主要富集在两个LD样品中，说明簇1中的蛋白质是LD EVs的标志物，但不能用于区分大小囊泡；簇2包含主要在小型LD EVs中富集的蛋白质；簇3富集了两种LD EVs（小型LD EVs和大型LD EVs）以及大型EVs；簇4和簇5包含小型EVs和小型HD EVs。3种最常见的标志蛋白（CD9、CD63和CD81）在不同的EVs亚型之间存在显著差异（图8 b），这些蛋白未在单个EVs亚群中富集，而是存在于几个亚群中。最后利用Western Blot验证定量蛋白质组学的结果（图8 c）。作者在另一篇研究中将EVs中的线粒体内膜蛋白鉴定为转移性黑色素瘤的潜在生物标志物。

图8 转移性黑色素瘤组织的EVs亚群中存在经典EVs标志物

结论

以上结果证实，转移性黑素瘤组织包含肿瘤细胞和免疫细胞。此外，在肿瘤间隙中可以发现大量大小不同的囊泡，其形态与EVs相似。重要的是，使用酶处理、差异超速离心和密度梯度分离技术，可直接从转移性黑色素瘤组织中分离出6个EVs亚群，而对分子或形态特征没有明显影响。这些EVs亚群在大小和浮力密度以及RNA和蛋白质方面明显不同。定量蛋白质组学结果显示，大型和小型LD EVs均富集了诸如flotillin-1之类的几种蛋白质，而小型LD EVs仅富集了ADAM10。相反，mitofilin仅在大型EVs中富集。通过提供直接从肿瘤组织中分离的EVs的几个亚群的详细分类，我们可能会更好地了解EVs在肿瘤生物学中的功能及其在生物标志物发现中的可能用途。

小编心得

（1）建立新的分离EVs亚群的方法：作者建立了一种直接从肿瘤组织中分离出EVs亚群的新方法，获得存在于肿瘤中的EVs的快照。由于这些EVs有可能在以后分泌到循环系统，因此可以利用此知识对EVs进行有针对性的分析。

（2）蛋白质组学助力EVs表征分析：作者利用多种不同的方法对分离获得的6种EVs亚群进行表征，其中蛋白质组学很好的体现了不同EVs亚群蛋白质水平的差异，一方面佐证了建立的新方法的正确性，另一方面获得了用来区分不同EVs亚群的蛋白标志物。如果说分离EVs的新方法拓展了EVs研究的横向深度，那么蛋白质组学的加入即扩展了EVs研究的纵向深度。

（3）未来研究的方向：作者最近使用该方法在黑色素瘤中鉴定与EVs相关的生物标志物候选物，证明了其在成功鉴定生物标志物候选物中的潜在用途。此外，作者对孤立的EVs亚群进行了全面的表征，从而深入了解了黑色素瘤肿瘤组织中EVs的亚群。该方法有可能用于改善除黑色素瘤以外的癌症中的生物标志物发现，未来的研究也可能探索由肿瘤组织中存在的不同细胞（例如炎性细胞、成纤维细胞或癌细胞）产生的囊泡亚群。