Nat Commun：磷酸化蛋白组学解析高等植物激酶级联介导早期渗透胁迫信号

渗透调节对植物生长发育和逆境响应有重要意义。SnRK2s（SNF1-相关蛋白激酶2s）能被渗透胁迫快速激活，是渗透胁迫和ABA信号通路的中心成分，但SnRK2激活和早期渗透胁迫响应信号的上游通路仍未可知。

中科院上海植物逆境生物学研究中心的朱健康课题组和王鹏程课题组于2020年1月在《Nature Communications》上发表了论文“A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants”。该研究报道了拟南芥渗透胁迫早期响应及ABA信号通路中RAFs的重要作用，并通过定量磷酸化蛋白质组学揭示SnRK2s的磷酸化激活及高等植物通过激酶级联反应参与渗透调节的机制。

实验材料：

CRISPR/Cas9产生的各种突变体

磷酸化蛋白组学：甘露醇处理30 min vs 对照处理，野生型及snrk-dec突变体植株：WT_con、WT_man、snrk2-dec_con、snrk2-dec_man

技术路线图：

结果分析

1.     渗透胁迫激活蛋白激酶OKs

为了研究渗透胁迫早期信号途径中的磷酸化事件，采用凝胶内激酶测定法（in-gel kinase assays）检测甘露醇处理后的激酶活性。发现甘露醇和ABA处理后，共4组蛋白激酶被激活。SnRK2.2/3/6（约40-42 kDa）被ABA和渗透处理强烈激活，然而ABA非依赖的SnRK2.1/4/5/9/10（37-40 kDa）被渗透处理强烈激活。除了SnRK2s，还发现约130 kDa和100 kDa两组蛋白激酶被渗透处理激活，而不受ABA激活，将其命名为OKs（osmotic stress-activated protein kinases）。渗透胁迫可快速激活OK活性，表明这些蛋白激酶在渗透胁迫早期信号传导中发挥作用。OKs的激活并不需要SnRK2s，并且不依赖于ABA信号传导，因为OK活性在snrk2.2/3/6三突变体（snrk2-triple）（缺乏ABA信号通路）和snrk2.1/4/5/7/8/9/10七突变体（snrk-sep）中依然被激活。

图1 渗透胁迫激活OKs和SnRK2s

2.     定量磷酸化蛋白质组学鉴定OKs

研究人员推测OKs是自磷酸化的，并且自磷酸化发生在两种基因型的植株中。为了确定OKs的特性，他们采用定量磷酸化蛋白质组学来分析野生型和snrk-dec突变体植株在渗透胁迫处理下的磷酸化水平的系统变化。在两种基因型植株中，18个蛋白激酶的21个磷酸化位点被甘露醇处理上调，其中包括RAFs（Raf-like protein kinases）的一些磷酸化位点。B4 RAFs（117-140kDa）包含一个N端PB1结构域和一个C端激酶结构域。两种基因型植株中，6个B4 RAFs的磷酸化位点被渗透胁迫显著上调。被甘露醇上调的还有RAFs的B2和B3亚家族蛋白（75-112kDa）的磷酸化位点，其中包括RAF4，RAF5/SIS8，RAF2/EDR1，RAF11，RAF10。 来自RAFs的部分磷酸化位点位于这些激酶的活化环中。活化环中位点的磷酸化是蛋白激酶活化的保守机制。综合这些结果，假设B4 RAFs的成员可能对应OK¹³⁰，而B3和B3 RAFs成员可能对应OK¹⁰⁰。

图2 磷酸化蛋白组学鉴定OKs

3.     突变体分析确认OKs为RAFs

为了证实上述假设，针对各种RAFs分别构建如下五种突变体：OK¹³⁰-weak，OK¹³⁰-null，OK¹⁰⁰-quin，OK-quatdec，OK-quindec，各突变体中基因表达情况如图3所示。在OK¹³⁰-weak中，OK¹³⁰的激活虽未完全削弱，却强烈削弱。这证实了假设的B4亚家族代表OK¹³⁰。甘露醇诱导的SnRK2.1/4/5/9/10的激活在OK¹³⁰-weak中显著消除，但未完全消除，表明SnRK2.1/4/5/9/10的激活依赖于OK¹³⁰。OK¹⁰⁰-quin表现出较强的生长抑制表型，而OK-quindec表现出极明显的生长抑制；与OK-quindec不同的是，OK-quatdec具有野生型RAF2/EDR1，其生长仅受到轻微抑制。在OK-quindec中，甘露醇引发的OK¹⁰⁰和SnRK2.2/3/6的激活几乎完全消失。外源ABA对OK-quindec幼苗SnRK2.2/3/6的激活程度明显低于野生型。综上结果表明，B4 RAFs对应于OK¹³⁰，而B2和B3 RAFs 的成员是OK¹⁰⁰。

图3 OKs作为遗传亚家族的的遗传学鉴定

4.     RAFs为抵抗渗透胁迫所需

分析RAFs多突变体对渗透胁迫的响应发现，OK¹³⁰-null（而非OK¹³⁰-weak）对甘露醇、氯化钠或者聚乙二醇（PEG）处理引起的渗透胁迫在种子萌发、幼苗生长和电解质泄露的测试中高度敏感；含有RAF24和RAF42弱等位基因的OK-quatdec对渗透胁迫的敏感性较弱，与OK¹³⁰-weak的渗透胁迫敏感性较弱一致。

5.     RAFs与SnRK2s相互作用并使其磷酸化

如前所述，B4 RAFs的激活在SnRK2s之前，并且为SnRK2s激活所需，表明B4 RAFs 可能直接通过磷酸化激活SnRK2s。通过检测重组B4 RAFs是否可能磷酸化SnRK2s，体外激酶实验研究ABF2（SnRK2受体，作为SnRK2活性指标）的磷酸化，及抗SnRK2.6-ps175抗体（识别SnRK2.6中Ser175磷酸化）进行免疫印迹实验，结合凝胶内激酶检测结果表明，渗透胁迫触发的SnRK2激活需要通过RAFs磷酸化SnRK2s，特别是活化环中保守的丝氨酸残基。

图4 RAF缺失改变渗透胁迫敏感性        

6.     RAFs为ABA-介导的SnRK2激活所需

OK-quindec中ABA触发的SnRK2活化的显著降低表明，RAFs可能调节ABA的反应。结合OK-quatdec突变体植株对ABA的响应表型，snrk2-triple表型，结果表明，RAFs也参与了ABA介导的SnRK2.2/3/6的激活。通过检测重组B2及B3 RAFs（RAF5/6/10-KDs）对SnRK2s（SnRK2.1/4/10/6/8）的磷酸化，进一步表明RAF激酶亚群与SnRK2s之间的特异性。与OK-quatdec突变体植物强烈的ABA不敏感表型相一致，渗透胁迫和ABA诱导的几个ABA敏感基因（如RD29B、RAB18和COR15A）的转录显著降低。

图5 B2和B3 RAFs通过磷酸化SnRK2s介导ABA信号通路

7.     构建ABA/渗透胁迫-RAFs-SnRK2s激酶级联反应模型

基于以上结果，作者最后提出了ABA/渗透胁迫-RAFs-SnRK2s激酶级联反应参与植物渗透调节模型。

图6 RAFs通过磷酸化SnRK2s介导早期渗透胁迫和ABA信号通路模型

小结：

在本研究中，作者揭示了拟南芥RAFs样激酶(RAFs)的B2、B3和B4亚家族在早期渗透胁迫和ABA信号通路中的重要作用。B2、B3和B4 RAFs被渗透胁迫迅速激活，是SnRK2s磷酸化和激活所必需的。对RAFs多突变体的分析揭示了RAFs在渗透胁迫耐受、ABA响应以及生长发育中的关键作用。整体揭示了高等植物通过激酶级联反应参与渗透调节的机制。

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