【DIA】 精彩不停歇——DIA拓展技能：解锁特殊及微量样本

近年来，随着生物科学研究的深入，逐渐发现生物系统样本存在组织异质性以及空间部位差异，蛋白质组学的研究趋势从传统的整个组织或者细胞团到5000个细胞以下的微量甚至是单细胞层面发展，以获取更加精准的生物系统信息，该技术被称为nanoproteomics（微量蛋白质组）。

然而目前微量蛋白质组面临的巨大挑战是：蛋白质分子不能像基因或者转录本可以进行提前扩增，且在进行质谱上机之前一系列复杂的预处理，不可避免的会引起一定的蛋白损失，使得在一些特殊微量或者珍贵的少量样本的蛋白质组学深度覆盖以及稳定性检测上仍然较为困难。比如LCM组织样本（laser capture dissection）、外泌体样本、FFPE (formalin fixed paraffin embedded)样本，胚胎发育的样本等。以上一些类型样本主要特点就是可获得的样本量较少，或者能够提取得到的蛋白数量也较少。如果采用传统的蛋白质组学手段，一方面由于采集的随机性，会造成重复性差；另外一方面由于其丰度依赖的特性，会造成鉴定深度受限尤其是非常有意义的低丰度蛋白的鉴定。简言之，传统组学手段进行此类特殊样本在采集深度以及采集定量稳定性方面有非常大的风险。

图1 特殊样本类型（图片来源 J Chromatogr A. 2017 November 10; 1523: 40–48. doi:10.1016/j.chroma.2017.07.055）

在综述性文章Nanoproteomics comes of age中提到，微量蛋白组甚至是单细胞蛋白检测的关键限制因素有两个: 一是蛋白质提取效率及良好回收率，另外一方面便是至关重要的质谱分析平台的灵敏性。前者主要是实验前处理进行优化，比如单微型化的油-气-液“三明治”芯片技术等等，其主要目的是有效提取蛋白，减少样本损失。后者主要依赖于质谱分析平台，说到这里估计大家都猜到了，没错，是它，是它，就是它-DIA。DIA对于特殊样本类型，比如血浆的高丰度干扰，微量蛋白类型，外泌体等特殊样本类型的蛋白深度覆盖及鉴定稳定性上有极大的提高。可参见以下文献案例。

01 特殊样本类型DIA应用案例-FFPE样本

2020年3月份，蛋白质组学领域著名专家Matthias Mann教授在《The Journal of Pathology》上发表题目为“A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large scale FFPE tissue analysis Fabian Coscia” 的研究论文。该研究成果介绍了一种针对于临床FFPE样本的蛋白质组分析工作流程。本文中采用优化的样本前处理方法，并采用DIA和DDA等不同质谱采集方法进行FFPE的样本的检测，该研究结果展示DIA模式下单针鉴定到约5000蛋白，该篇研究成果提示出DIA技术在FFPE类型大队列样本的高通量应用潜力。FFPE鉴定水平可参见如下数据，在不同肿瘤体系中DDA鉴定水平（Figure 2.A）和DIA模式下的鉴定水平(Figure 2.E)。

图谱出处：文献10.1002/path.5420

Figure 2.A（左） and Figure 2.E.（右）

02 微量样本DIA应用案例-胚胎组织

2019年宾夕法尼亚大学表观遗传学研究所研究团队发表在《Anal Chem》杂志上的题目为“Single Cell Proteomics by Data-Independent Acquisition to Study of Embryonic Asymmetry in Xenopus laevis”的研究成果，采用DDA和DIA两种方式进行非洲爪蛙胚胎不对称性功能研究，从130 μm非洲爪蛙胚胎细胞含有小于6nl的细胞质总鉴定到超过1600 种蛋白(见下图)，从以下对比结果中可以看出，采用DIA模式采集的蛋白数量明显高于DDA模式下的结果。

图谱出处：文献doi:10.1021/acs.analchem.9b00327  figure1E

前方高能，请注意

• 石蜡切片(formalin fixed paraffin embedded)样本

是指使用福尔马林固定石蜡包埋处理的临床样本，在医院或者组织样品库中。其中绝大多数是石蜡包埋的样品。该类样本通常蕴含了大量的病理信息，因此对于探究疾病机制，发现治疗靶标和指示预后恢复都具有重大意义。但是通常该类样本经过甲醛固定后，形成分子交联形式，且少量组织样本被包裹在石蜡当中，对此类特殊样本的有效提取，并保持较好的肽段回收率是进行蛋白质大规模检测的主要障碍。中科新生命对FFPE样本制备方法进行优化，建立了特色FFPE的蛋白提取及制备方法，同时采用 DIA技术路线进行数据采集。在大规模鉴定结果中，与Matthias Mann近期发表的FFPE大规模DIA方法的文献水平相当。

• 激光捕获显微切割 (LCM) 的样本

是从显微镜下从混合样品中分离出特定的组织，该类型特点是样本尺寸较小，但是该类型样本对于肿瘤组织空间异质性研究非常具有意义。但是由于本身特性导致可获得的原始样本量非常少，在传统蛋白质组学实验中难以达到正常鉴定需要的标准及要求。因此在该类样本中尽可能的提高蛋白提取效率以及避免样本损失对提高LCM类型的蛋白鉴定水平提高非常关键。在此类项目经验中，中科新生命采用传统的DDA模式进行labelfree定量技术以及DIA全扫描方式两种技术路线进行LCM样本分析。从鉴定数量上来看，采用DIA方法相对于传统组学手段，蛋白鉴定数量提高近100%，充分发挥了DIA技术在微量样本中无偏见扫描，低丰度信号覆盖中的优势。

• 血浆外泌体（exosome）及血浆血清类

该类型样本大家较为熟知，主要是存在大量高丰度蛋白的干扰，传统的DDA扫描模式主要就是丰度依赖的特点，所以需要通过去除高丰度或者分级的方式来分离高丰度蛋白，以去除干扰，提高该类样本的蛋白鉴定数量。中科新生命项目经验在此样本中的DIA蛋白方法尚也颇具实力，经过优化的DIA方法，在不去除高丰度蛋白的条件下，血浆外泌体样本鉴定数量比文献平均水平提高40%，血浆血清类样本鉴定水平提高近50% ， 不仅节约大量的实验成本，同时获得优秀的鉴定数量。

中科新生命DIA平台特殊样本鉴定能力

小结

DIA技术的应用越来越广泛，主要原因还是得益于其无偏见的扫描模式，定量稳定性以及重复性等特点。目前中科新生命不仅在常规样本的大队列样本检测方面积累了大量的经验，同样也在特殊类样本领域中积累了丰富的经验。不仅为您解决样本难题，更为您提供满意的结果，是您值得信赖的优质DIA平台。接下来，DIA将持续为大家带来更多惊喜，敬请关注。