新冠诊断获重大突破：蛋白质组检测或可实现病情分类诊断！

2020年一场突袭而来的新冠肺炎成为威胁全球的公共卫生事件，至今仍然严重影响着全世界人民的生活，及时有效诊断并及时隔离新冠肺炎患者成为切断新冠肺炎传播的重要途径。目前新冠肺炎诊断的主要方式是新型冠状病毒核酸检测，但是该方法仅能检测病人病毒阴性或阳性，无法判断患者是轻症或为重症，更不能预测新冠病人的疾病严重程度，因此对于新冠病人的及早干预及个体化治疗也不利。

在2020年5月3日，英德多国科学家合作，于医学类预印本杂志medRxiv（此前钟南山院士团队也在该预印网站上发表了重要新冠肺炎论文）上，发表了题目为Clinical classifiers of COVID-19 infection from novel ultra-high-throughput proteomics的研究成果。

该研究开发了新型超高通量COVID-19感染的临床分类蛋白质组学方法，该方法利用5分钟的超短色谱梯度以及数据非依赖性采集方式DIA方法对新冠疾病患者进行蛋白质组学检测，发现27种蛋白质可以有效区分轻症和重症新冠肺炎，其中一些蛋白还可能是潜在的治疗靶点。

技术路线

主要结果及结论

快速高效的新冠肺炎标志物筛选与诊断

新冠肺炎标志物研究的筛选队列中，选择104例新冠肺炎血清队列（包含根据WHO分类的不同严重程度样本），一共采集到297种蛋白，统计学方法筛选得到37种显著性变化的蛋白与新冠疾病严重程度相关。在验证队列当中，通过15例健康人及17例新冠肺炎血浆样本当中，鉴定到319种蛋白，并且再次确认到27种显著性改变的蛋白，与新冠肺炎的严重程度密切相关。

下图b-PCA图可以明显反映出疾病进程的区别；在c-聚类分析图谱中，这些差异蛋白可以将疾病划分为不同严重的程度模式。并通过箱线图可以看出在不同疾病严重程度的区别。

通过对显著性改变的蛋白功能分析，发现这些蛋白主要与炎症反应和急性时相相关，比如IL-6通路，补体通路，c-反应蛋白，白蛋白等。这些发现的蛋白不仅可以做新冠严重程度的标志物，而且可作为毒理机制研究以及潜在的治疗靶点。

关于新的诊断技术

1. 技术选择和优化

该研究采用的是新一代蛋白质组技术——DIA。DIA技术区别于传统技术，是一种全扫描的蛋白质组技术，不仅能满足大量指标同时检测蛋白质组分析要求，还同时具备高稳定性、高准确性的分析能力，近来在科研领域已经取得大量的重要应用成果，并被美国癌症登月计划采用。

为了满足临床诊断的需求，尤其是快速诊断的要求，研究者进一步对该技术进行了改进和优化：在方法建立阶段，着重考虑两个关键问题，一是样本处理的规范化，另外一个是质谱数据采集的方法选择。在样本制备阶段，主要采用96孔板并联液体工作站进行标准化操作，大大减少实验批次偏差。在质谱采集阶段，主要考量因素是质谱采集方法要满足大队列采集变异少，在此选择数据非依赖性采集模式DIA模式进行数据采集和后续分析。通过优化的方法，作者计算了理论一天可处理样本达384个，一天质谱采集数据可达180个。这样的高通量大大满足了临床检测的需求。

2. 基本分析效果评价

对质谱检测数据进行一系列评价，从TIC重叠性（figure a）、标准肽段保留时间（figure b）、半峰宽（figure c）以及色谱峰容量（figure d）等指标确定优化的高通量方法可以满足检测条件及要求。

3. 在临床血浆血清样本中进行大规模效果评价

对已经建立好的方法进行体系定量准确度检测，采用199例GS血浆样本进行大规模组学，实现了5min DIA的质谱方法，血浆样本检测蛋白质数量平均约270个，并且定量到约50种FDA批准的标志物。在此，作者特别指出，在大队列的研究当中，能够持续并且稳定被定量到的蛋白比追求鉴定的最大数量更加有意义，因为只有被稳定检测到的物质才有可能转化为临床指标。同时在该项研究中，为了评价定量准确性，从PCA图的分布上可以分离不同来源的样本，以及不同生物学重复和技术重复的样本。并且对定量的CV值进行评价，在QC的CV中位数为5.4%。充分反映出该方法从制备到数据采集及分析过程的稳定性。

小结

目前的新冠肺炎检测主要以核酸检测为主，检测病毒本身在体内的存在情况。该篇研究从宿主对病毒的反应角度出发，通过检测人体的蛋白表达，来进行新冠肺炎的诊断，尤其是实现对病情的归类，并在此基础上进一步理解机体对新冠的反应机制，以及找到可能的治疗靶点。从技术方法上来说，其建立了一种创新性的基于质谱的快速高通量筛选检测新冠肺炎蛋白标志物的方法。利用5分钟的超短色谱梯度以及数据非依赖性采集方式DIA方法，在不进行去血清高丰度的前提下，对新冠疾病患者血样进行蛋白质组学检测。该研究成果反映了蛋白质组学的应用不仅限于科学研究层面，对于推动质谱技术临床转化应用也更具潜力和价值。