Matthias Mann团队发表DIA大队列标志物筛选新策略

DIA（Data-Independent Acquisition，数据非依赖性采集）技术可无偏向性采集质谱扫描范围内的所有信号，实现真正的信息全息扫描。是大队列样本生物标志物研究的优选方法之一，具有以下特点：

(1) 全息扫描：数据随机缺失值减少数倍；

(2) 高重现性、稳定性：鉴定重复率提升近40%，定量精密度提升近1倍；

(3) 高准确度：定量能力接近金标准MRM技术；

(4) 可追溯性：可实现回溯性分析以及多批数据整合分析。

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老龄人口中发病率最高的疾病之一，且随着老龄化社会进程加剧，发病人数增长迅速。然而该疾病在潜伏期及发病初期临床症状并不明显，因此难以及早干预和及早治疗。DIA蛋白质组学技术的发展，为早期诊断阿尔兹海默症提供了有力的武器，也是科研研究热点之一。

2020年6月著名蛋白质组学领军人物德国马普生物化学研究所所长Matthias Mann教授在Molecular Systems Biology（IF 9.8）杂志上发表题目为 《Proteome profiling in cerebrospinal fluid reveals novel biomarkers of Alzheimer’s disease》的研究成果，介绍了一种标志物筛选的新策略-矩阵策略，利用DIA全息扫描蛋白质组学技术进行脑脊液（简称CSF）深度蛋白质组学分析，寻找阿尔兹海默病的疾病的新型诊断标志物。

相较于传统标志物筛选策略技术路线先筛选后验证的经典方法，本研究主要特点是采用平行策略，即采用不同地域（瑞士、柏林、马格德堡）来源的三个独立队列共197例人群的脑脊液样本，同时进行制备和大规模蛋白质组学分析，然后通过三个队列蛋白质组的整合和独立对比，寻找一致的差异表达蛋白，同时完成标志物的筛选与验证。最终发现40种蛋白特征分子可以有效诊断阿尔兹海默病疾病，并通过机器学习的方法对该疾病进行类别划分。

实验材料：人脑脊液

实验分组：分为瑞士、柏林、马格德堡三个队列，每队列分别包括非阿尔兹海默病组（简称non-AD 组）及阿尔兹海默病组（简称AD 组）

主要技术路线如下：

主要结果：

1. 三个队列蛋白质组学数据质量评估

利用Q Exactive HF-X Orbitrap mass高分辨质谱平台，对197例脑脊液样本进行DIA模式数据采集，首先对鉴定结果从蛋白鉴定水平和定量波动（CV）两方面进行质量评价。每个样本平均检测蛋白为检测到1233个， 约50%的样本能够重复检测到的蛋白达到1288个，占总蛋白的87%。通过定量变异波动分析发现，约1000种蛋白的定量波动性低于20%。以上结果表明实验具有高度重复性和定量稳定性。

2. 三个队列差异表达蛋白一致性分析

对瑞士、柏林、马格德堡三个队列的蛋白质组学结果分别进行统计及差异比较，以考察不同来源队列差异蛋白的一致性。在瑞士队列和马格德堡队列的结果比对中，一共占89% (172/194 proteins) 的差异蛋白具有相同的上下调趋势；在瑞士队列和柏林队列的结果比对中，95% (70/74) 的差异蛋白具有相同的上下调趋势（图3左）。在柏林和马格德堡队列的比较当中，93% (64/69)的差异蛋白具有相同的上下调趋势。且更加一致的是检测到的差异蛋白变化最剧烈的均是tau蛋白并且富集到的显著功能均为神经元与突触相关。结果表明三个队列虽有地域差异，但是AD与非AD病人差异表达的蛋白大多数一致性较好。

3. AD 组与non-AD组的区分效果

对三个队列所有组学数据集进行无监督聚类分析，评价是否可以有效区分AD组与non-AD组。结果展示，蛋白质结果可以很好地将两组分开，而与是否来源于某个区域无关（图4左）。后续作者选择在不同队列中表达趋势一致的40个蛋白特征分子作为重点进行分析，进一步将临床指标进行对应,发现与t-tau蛋白浓度以及临床评分MMSE score（mini-mental state examination）值均有较好的相关性。

4. 机器学习对AD进行再分类

利用机器学习的方法对26个核心蛋白对AD再分类，发现用其中14个蛋白的强度可以对AD状态进行有效分类，并通过常见的集成学习方法进行验证，ROC曲线显示具有较好的检测灵敏性和特异性。并通过交叉验证模型，其中88个AD病人中有72可以被有效识别，109个non-AD病人中有95个可以别有效识别，灵敏性和特异性分别达到82%和87%。

总结：

本文分享了一种标志物筛选的新思路——矩阵策略法。通过设计多个独立队列，实现筛选和验证平行进行，一步到位，避免不同实验方法引入的差异影响。在本研究中，采用DIA全息扫描蛋白质组学技术，实现大队列高通量检测，同时保证技术和数据的高重复性和高稳定性。在筛选到的标志物中，进一步结合临床数据以及机器学习等方法综合进行标志物评价，再次验证标志物的可靠性。