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新品应用 | 靶向蛋白方法PRM助力新冠病毒检测

2020-10-19

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)引发的全球卫生安全问题目前仍在威胁着全世界人民的生命健康。目前核酸检测是病毒检测的金标准,主要采用RT-PCR的扩增法对鼻拭子和咽拭子,以及痰/粘液等样本进行检测,确定是否含有病毒核酸特异成分。但该方法对于试剂耗材依赖性高,且无法判断是否存在活动性感染。基于质谱的靶向蛋白质组学技术-PRM能够在单一氨基酸水平上识别和定量蛋白质或多肽子分子,具有灵敏度高,重现性好的特点。该方法可特异性检测目标蛋白,为临床应用提供了极大潜力。

2020年9月,美国阿斯利康研发中心Sonja Hess研究团队在《Analytical chemistry》上发表题目为“Development of a parallel reaction monitoring (PRM) mass spec-trometry-assay for the detection of SARS-CoV-2 spike glycoprotein and nucleoprotei”的研究成果。该研究基于质谱法的靶向PRM技术原理,建立了SARS-CoV-2的目标靶向质谱方法,依据SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)和核衣壳蛋白(NP蛋白)肽段序列的质谱响应进行病毒抗原目标蛋白的定量,并通过定量结果进行病毒颗粒滴度预测。

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该方法的优点是不受限于样本类型,不仅适用于新鲜制备生物学样本,也可用于归档存储样本或其他体外样本的检测。总而言之,基于靶向的质谱方法具备更高的通量和安全性,具有高灵敏、高稳健的临床诊断价值,或可成为核酸检测的一种补充方法,成为未来病毒检测的亮点研究。

实验材料:

外源合成SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)和核衣壳蛋白(NP蛋白)全长,SARS-CoV-2感染肾上皮细胞的上清液,肺上皮细胞粘液分泌物,体外衍生粘液

组学技术方法: 

靶向蛋白质谱PRM技术

PRM检测技术路线:

分为两个阶段,一是PRM分析方法的开发阶段(目标蛋白候选特有肽段的筛选阶段);二是PRM分析方法的实际应用(根据前期已建立PRM方法,在实际样本中靶标肽段含量的检测)

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探索思路

1、PRM方法开发:确定候选靶标肽段

首先,作者将SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)和核衣壳蛋白(NP蛋白)添加到体外衍生粘液中,并添加IRT内标多肽进行绝对定量方法建立。通过靶向质谱方法检测到两个关键肽段,分别来源于S蛋白的FQTLLALHR肽段与NP蛋白的DQVILLNK肽段(下表)。绝对定量检测限和定量限分别为195amol和390amol,说明质谱方法达到较好的灵敏度。通过靶向PRM方法建立,后续以该两条肽段作为后期评估SARS-CoV-2病毒粒子的感染指标。

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图1 靶向PRM肽段定量结果

2、PRM检测方法应用:在高、低病毒模拟样本中进行PRM检测

质谱方法建立成功后,作者在含有高、低浓度SARS-CoV-2病毒粒子的模拟样本中进行测试。结果显示:NP蛋白最佳肽段在高低浓度病毒样本中检测结果分别为227和422amol,S蛋白最佳肽段在高浓度病毒样本中为553 amol。

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图2 不同浓度的靶向PRM肽段定量结果

3、PRM检测方法应用:在真实临床样本(鼻拭子和唾液样本)验证PRM方法灵敏度

 为了进一步验证PRM方式在真实临床样本中检测的灵敏度,作者评估了模拟样本SARS-CoV-2病毒滴度,大约在~9.3E6 pfu/ml。作者将鼻拭子和唾液样本中的SARS-CoV-2病毒滴度检测范围与PRM方法检测范围进行比较,结果表明一种通过定量SARS-CoV-2刺突蛋白和核衣壳蛋白的PRM方法,其具有足够的灵敏度,来检测病毒滴度在1-2E5范围内临床患者粘液样本,并且在PRM方法也可用于评估唾液、水道、废水等环境材料组中病毒的污染情况的检测。

小编小结

该篇研究通过靶向质谱技术PRM,建立特异性的蛋白质谱方法,对新冠肺炎病毒抗原进行靶向定量,为靶向PRM的临床应用提供了参考。PRM(平行反应监测,Parallel Reaction Monitoring)是目前靶向蛋白质组学数据采集的主流方法,通过对特异性肽段或目标肽段(如发生翻译后修饰的肽段)进行选择性检测,从而实现对目标蛋白质/修饰肽段的靶向相对或绝对定量。相对于传统的抗体法具有不受限于物种限制,检测通量一次性可达数十种蛋白等特点,且特异性更高。目前在蛋白质组学功能蛋白验证、目标蛋白定性定量、以及标志物队列验证等各个方向均具有较好的应用。

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代表客户文献

[1] Lysozyme-Assisted Photothermal Eradication of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection and Accelerated Tissue Repair with Natural Melanosome Nanostructures. ACS Nano  2019 ;11153-11167 TMT+PRM (IF=13.9)

[2] KIF5A-dependent axonal transport deficiency disrupts autophagic flux in trimethyltin chlorideinduced neurotoxicity. Autophagy 2020; 1-22 TMT+PRM (IF=11.1)

[3] Exploiting the protein corona: coating of black phosphorus nanosheets enables macrophage polarization via calcium influx. Nanoscale   2020 1742-1748 label-free+PRM (IF=6.9)

[4] Integrated analysis of transcriptomic, miRNA and proteomic changes of a novel hybrid yellow catfish uncovers key roles for miRNAs in heterosis. Mol Cell Proteomics  2019 1437-1453 转录组+miRNA+TMT+PRM  (IF=5.2)

[5] Proteomics in plasma of ovariectomized rats and those exposed to estradiol valerate. J Steroid Biochem Mol Biol. 2017 1-12  iTRAQ+PRM (IF=4.5)


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