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代谢流分析技术：检测代谢通路的活跃程度

2021-07-15

中科新生命

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在之前的推文中小编已经介绍过代谢流的基本概念即利用稳定同位素示踪技术析下游代谢产物的同位素标记模式，从而推算出该化合物在代谢通路中的流向和分布；通过对生物体进行代谢流分析，可得到生物体特定代谢通路的活跃程度。利用代谢流技术的研究成果也频繁登上高分杂志。本次将为大家带来靶向代谢流分析的基本流程的介绍：

01 基于质谱的代谢流分析流程和原理

完整的代谢流分析流程一般包括：稳定同位素标记样本的制备、色谱-质谱检测、标记和非标记代谢物定量、天然同位素丰度矫正和计算标记特征等几个步骤：

1）稳定同位素标记

根据实验目的选择合适的稳定同位素标记底物，通过置换标记培养基或者注入动物体内来实现下游代谢物的标记，后达到代谢稳态。如[U-¹³C]glucose可流入中心碳代谢途径（EMP/TCA/PPP）及其分支途径；[U-¹³C]glutamine可流入TCA循环、谷氨酰胺和谷氨酸代谢、脂肪酸合成途径；[1,2-¹³C]glucose可用于区分糖酵解途径和戊糖磷酸途径；[U-¹³C]lactate可流入糖异生途径……

另外样本收集的时候要通过快速淬灭代谢酶来获得更准确的实验结果，一般可以通过液氮速冻或者快速加入低温预冷的挥发性有机溶剂来实现。

2）LC-MS检测

通过靶向代谢组学方法，同时检测代谢物的非标记形式（M+0）和标记形式（M+n）来表征代谢的标记状态。针对目标代谢物的理化性质选择合适的检测方案有助于提高检测的灵敏度。

3）天然同位素矫正

天然稳定同位素也会造成较高的质量数。例如，测量得到的M+1，有可能是1个碳原子被¹³C 标记，也有可能是1个氢原子被²H 标记，或者1个氧原子被¹⁷O标记的所有可能情况的丰度总和。因此需要对数据矫正元素的天然同位素丰度，以获得真实的质量分布向量即Corrected MDV（MDV的解释见下文）。

4）计算标记特征MDV／MID

质量分布向量 (mass distribution vector，MDV) 也叫做质量同位素分布向量 (mass isotopomer distribution vector, MID vector) ，描述的是标记模式下代谢物的每个同位素分布的比例，如下图所示，不同同位素标记形式（M+1，M+2…）反映了通过不同代谢途径得到的产物量，通过计算MID可以帮助比较不同代谢通路的活性。