Plant Cell（IF 11.277）| 内质网质膜接触部位的突触体在非生物胁迫期间维持甘油二酯稳态
2021-12-31
中科新生命
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温度和水分等非生物胁迫会对植物生长造成负面影响。与动物不同，植物无法逃避这些不利条件，因此它们进化出多种机制来感知和适应这些压力。其中，胁迫感应后发生在质膜（PM）上的脂质信号控制着重要的植物适应过程。在信号传递过程开始时产生的这些PM脂质信号之一是二酰甘油（DAG）。然而，这种脂质在细胞膜中的积累可能是有毒的，导致膜完整性的丧失。因此，有效清除DAG对于重置系统功能和保持PM完整性至关重要。
2021年5月，西班牙马拉加大学的研究人员在Plant Cell（IF 11.277）杂志上发表题为“Synaptotagmins at the endoplasmic reticulum-plasma membrane contact sites maintain diacylglycerol homeostasis during abiotic stress”的研究成果，利用脂质组学技术研究植物在非生物胁迫后PM控制DAG稳态的机制，揭示了一种突触体蛋白（Syptotagmins，SYTs）依赖的应激适应机制，可以抵消非生物胁迫期间产生的DAG在PM处的有害积累。 研究材料 拟南芥的不同株系：WT野生型、syt1突变体、syt3突变体、syt1/3双突变体 处理条件：对照条件、冷处理条件 技术路线 步骤1：SYT1和SYT3在非生物胁迫下对质膜稳定性起重要作用； 步骤2：SYT3位于内质网-质膜接触位点； 步骤3：SYT1和SYT3通过与PI4P的交互作用来栓住PM； 步骤4：SYT1和SYT3在质网-质膜接触位点CS显示冷依赖动力学； 步骤5：SYT1和SYT3在冷应激条件下维持质膜DAG动态平衡； 步骤5：SYT1在体内优先与DAG结合。 研究结果 1. SYT1和SYT3在非生物胁迫下对质膜稳定性起重要作用 早期的研究证实，SYT1基因是各种非生物胁迫下细胞生存能力的重要决定因素。作者研究了SYTs是否在抗逆性中发挥作用，发现在低温胁迫24小时可诱导SYT1和SYT3表达。进一步研究它们在非生物胁迫条件下参与细胞存活的特性，结果发现SYT1和SYT3在维持PM稳定性方面起着冗余作用，以响应苗期和成株期不同的非生物胁迫。 图1 SYT1和SYT3在非生物胁迫下对质膜稳定性起重要作用 2. SYT3位于内质网-质膜接触位点（ER-PM CS） SYT3在拟南芥信息资源数据库（TAIR）中被认为是无功能的，这与前期研究结果明显不一致性，因此，作者使用现有的RNAseq数据库和RT-PCR扩增技术进行了详细的序列分析，然后对cDNA片段进行测序，鉴定出五种剪接变体，其中四个变体编码非功能蛋白，只有与SYT3-GFP构建体（AT5G04220.2）所用序列一致的转录本可以编码完整的SYT3蛋白，其结构域与SYT1相似，亚细胞定位发现SYT3与SYT1一起定位于ER–PM CS。 图2 SYT3位于内质网-质膜接触位点（ER-PM CS） 3. SYT1和SYT3通过与PI4P的交互作用来栓住PM 早期的研究表明，SYT1的C2A结构域以Ca2+依赖的方式结合含有磷脂酰丝氨酸（PS）和PC的人工脂质体，而SYT1-C2B的结合不依赖于Ca2+。本文中研究SYT3 C2A和C2B结构域的Ca2+依赖性磷脂结合特性，发现SYT3-C2A结构域与谷胱甘肽-S-转移酶（SYT3-C2A-GST）以Ca2+依赖的方式结合带负电荷的脂质体（25% PS/75% PC）。而SYT3-C2B-GST显示与这些脂质体存在一些Ca2+非依赖性结合。这些结果表明，SYT3的C2B结构域可能包含额外的Ca2+结合位点，这些位点与标准位点不同。除了PS，C2结构域还可以结合其他带负电的磷脂。由于PI4P是在PM内表面产生负电荷的主要决定因素，作者还研究了PI4P在ER–PM CS体内SYT3-GFP和SYT1-GFP定位中的作用，结果发现SYT1和SYT3可以通过与PI4P的交互作用来栓住PM。 图3 SYT1和SYT3通过与PI4P的交互作用来栓住PM 4. SYT1和SYT3在ER–PM CS显示冷依赖动力学 SYT1最初被鉴定为一种PM蛋白，在寒冷胁迫下积累在PM组分中。然而，使用特定的SYT1抗体，没有检测到WT或syt3突变体冷暴露1、3或7天后SYT1总蛋白的累积增加。这表明SYT1蛋白的总量既不因冷处理而改变，也不因缺少SYT3而改变。但是SYT3的表达则是由几种应激引起的，包括冷应激，与SYT1相比，冷处理可诱导SYT3-GFP表达（倍数约为6倍）。 接下来，作者使用SYT1:SYT1-GFP和35S:SYT3-GFP在冷应激下研究SYT1-GFP和SYT3-GFP的亚细胞动力学。在对照条件下，在cER处观察到SYT1-GFP和SYT3-GFP显示出特征性图案；在寒冷处理24小时后，皮质平面上的SYT1-GFP和SYT3-GFP信号增加。图像分析证实冷处理后SYT1-GFP和SYT3-GFP的定位发生显著变化。冷处理后3小时、15小时、24小时和3天对SYT1-GFP信号的定量分析表明，3小时时皮质积聚增加，一直持续到3天。而较短的冷处理（10分钟和30分钟）不会对SYT1-GFP定位产生任何显著变化。为了评估SYT1和SYT3之间异源二聚体的形成，以WT背景下的SYT3:SYT3-GFP株系为材料，在对照条件下或冷处理24小时后，使用免疫共沉淀（CoIP）分析其相互作用。在这两种情况下，SYT3-GFP与内源性SYT1蛋白共表达，表明在体内存在关联。 图4 SYT1和SYT3在ER–PM CS显示冷依赖动力学 5. SYT1和SYT3在冷应激条件下维持质膜DAG动态平衡 为了评估SYT1和SYT3蛋白在甘油脂质稳态中的可能作用，作者分析了WT、syt1、syt3和syt1/3在对照条件下以及在4°C温度下7天后的叶片脂质组。利用脂质组学技术检测到了九类甘油脂质中的181种分子。在WT中，冷胁迫导致大多数脂质的不饱和度增加，单半乳糖基二酰甘油（MGDG）减少，不饱和三酰甘油（TAG）积累。syt1、syt3和syt1/3的总甘油脂质组成在对照条件下和冷处理后与WT相似，排除了SYT1和SYT3蛋白在冷应激后发生的实质性脂质重塑中的作用。 作者进一步研究了WT和syt1/3的PM在冷处理3天后发生的脂质变化，在该时间点，SYT1在ER–PM CS聚集。对PM组分的78种甘油脂质进行定量，在WT和syt1/3的PM主要脂质成分（如PE、PS、PG和PA）没有显著变化，而PC和DAG存在显著差异。值得注意的是，大多数DAG分子种类显示出在syt1/3的PM积累的趋势，其中DAG32:2和DAG32:4是最丰富的分子。 图5 SYT1和SYT3在冷应激条件下维持质膜DAG动态平衡 6. SYT1在体内优先与DAG结合 之后，作者分析了与功能性SYT1-GFP共沉淀的甘油脂质，鉴定与SYT1 SMP结构域结合的甘油脂质。在SYT1-GFP样本中鉴定的35种脂质中，有24种是DAG，其中最丰富的为DAG32:2和DAG34:2，这与syt1/3的PM中差异积累的DAG分子一致。这一结果证明了SYT1和SYT3在将DAG从PM运输到ER中的作用。 图6 SYT1在体内优先与DAG结合 小结 中科优品推荐 【中科新生命】基于高分辨脂质组学平台 170 万种脂质分子谱图库，对生物样本进行脂质组相对定量和绝对定量分析，生信分析内容丰富多样，可揭示生理/ 病理过程中的脂质变化。
该研究揭示了一种依赖突触体蛋白SYT的胁迫适应机制，该机制抵消了非生物胁迫期间产生的二酰甘油在质膜上的有害积累。脂质组学分析表明，与野生型相比，低温胁迫增加了突触体蛋白缺失突变体中PM处二酰甘油的积累。本研究深入解析了脂质分子在植物应对非生物胁迫中的作用，为作物冻害防治提供了新的思路。
