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项目文章Nature(IF 49.962)| 植物和病原菌“军备竞赛”! 为水稻抗病育种带来新突破

2022-01-18
中科新生命
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稻瘟病是由真菌 Magnaporthe oryzae 感染引起,严重威胁水稻产量,甚至可能导致绝产。如何让作物获得广谱抗病性,是植物与病原菌间的“军备竞赛”。在植物与病原菌互作中,植物建立了两层免疫防卫体系,即病原相关分子模式激发的基础免疫反应(PTI)和效应蛋白激发的特异性免疫反应(ETI),两者能够协调并共同作用促进防御代谢物产生并对抗病原体,然而它们具体如何协调,并激发广谱抗性仍有待探究。

2021年12月16日,国际顶尖期刊Nature(IF 49.962)在线发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心何祖华等研究组,题为 “NLRs guard metabolism to coordinate pattern- and effector-triggered immunity” 的论文,揭示了一条全新广谱免疫代谢调控通路:PICI1—OsMETS—蛋氨酸—乙烯通路,并证明水稻广谱抗病蛋白NLR受体调控该代谢通路保护植物,协同整合PTI和ETI,赋予水稻广谱抗病性的新策略,为农作物抗病育种设计奠定理论基础。其中,中科新生命提供了TMT蛋白质组、泛素化蛋白鉴定服务


研究材料

水稻(目标基因敲除或过表达的转基因水稻)

技术路线

· 步骤1:蛋白质组及蛋白互作分析筛选广谱抗性NLR蛋白的关键作用因子;

· 步骤2:PICI1在ETI和PTI中发挥功能;

· 步骤3:PICI1通过去泛素化作用稳定OsMETS;

· 步骤4:OsMETS稳定积累增强了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性;

· 步骤5:PigmR保护PICI1不被AvrPi9降解,PICI1的自然变异有助于亚种免疫分化。
研究结果

1. 蛋白质组及蛋白互作分析筛选广谱抗性NLR蛋白的关键作用因子

以往研究发现,水稻NLR受体蛋白PigmR具有广谱抗稻瘟病能力,表明其可能整合了PTI和ETI两种途径以保证其广谱抗性。为识别关键调控因子,首先通过TMT定量蛋白质组,筛选Chitin诱导植物免疫后的关键差异蛋白(与PTI相关);随后通过酵母双杂(Y2H),筛选与PigmR受体相互作用的蛋白。结合两者筛选结果,获得交集的候选蛋白称为PICIs (PigmR互作及chitin诱导蛋白),并进行后续深入研究。


图1 关键免疫调控因子PICIs的筛选

2. PICI1在ETI和PTI中发挥功能

进一步,通过免疫共沉淀及共定位等实验,确认了PICI1与PigmR相互作用。随后,在野生型近等基因Pigm株系(nili -Pigm)中构建PICI1基因敲除株系、PICI1基因过表达株系(PICI1- OE),发现较野生型和过表达株系相比,敲除株系(PICI1- KO)的抗病性显著降低。接下来,进一步分析PICI1在PTI中的作用,发现Chitin可诱导PICI1表达,且在PICI1敲除株系(PICI1-KO)中,Chitin诱导的活性氧产生和病原体相关疾病表达被抑制,而在PICI1过表达株系中(PICI1-OE)得以增强。综上表明,PICI1与PigmR相互作用,并介导ETI和PTI反应。


图2 PICI1通过与PigmR相互作用,参与PigmR介导抗病性与PTI反应

3. PICI1通过去泛素化作用稳定OsMETS

随后蛋白序列结构域分析及实验确认,表明PICI1是一种去泛素化酶。为鉴定其底物,进行了PICI1的免疫共沉淀及质谱分析(IP-MS)将得到的互作蛋白与Chitin诱导的泛素化变化蛋白相交,筛选到20个泛素化候选蛋白,其中包括一个在单子叶和双子叶中高度保守的蛋氨酸(Met)合酶(LOC_Os12g42876)。结合体外及体内等一系列实验,发现PICI1存在时OsMETS1-Flag稳定积累,综上说明OsMETS1是PICI1的底物,PICI1通过去泛素化作用稳定OsMETS。


图3 PICI1是去泛素化酶,通过去泛素化作用稳定OsMETS

4. OsMETS稳定积累增强了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性

随后探究了OsMETS的抗病功能,确认了Chitin或flg22处理引发OsMETS表达积累,蛋氨酸(Met)介导免疫作用可通过诱导病原体相关基因观察到剂量依赖的Met介导的抗瘟性。综上表明,OsMETs介导的的生物合成,并在抗稻瘟病中发挥了重要作用。由于Met是乙烯在植物免疫中的前体,用Met处理能增加乙烯的产量,故进一步分析OsMETs是否通过提高乙烯合成发挥作用。实验表明,采用ACC(乙烯前驱体)预处理增加了抗瘟性,而AVG(乙烯生物合成抑制剂) 预处理降低了抗瘟性。总之,OsMETS稳定积累增强了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性。


图4 OsMETS稳定积累增强了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性

5. PigmR保护PICI1不被AvrPi9降解,PICI1的自然变异有助于亚种免疫分化

由于水稻在与病原菌长期处于类似于“军备竞赛”的协同进化中,通过PICI1互作分析找到了病原菌分泌的毒性蛋白(AvrPi9),其能通过降解PICI1,抑制水稻的基础抗病性(PTI),以有利于病原菌的入侵。然而,水稻进化产生的广谱抗病NLR受体可以通过抑制病原菌毒性蛋白与PICI1的互作,保护并加强PICI1的功能,进而激活更多的防卫化学物质(蛋氨酸—乙烯)的合成,以获得广谱抗病性。

最后,对3000份水稻品种的基因组数据分析发现,PICI1启动子具有籼粳分化的自然变异位点,与水稻对稻瘟病的田间抗性紧密关联,从而为水稻抗病育种提供了新的靶点。


图5 PigmR保护PICI1不被AvrPi9降解,PICI1自然变异有助于亚种免疫

小编小结

本研究综合利用蛋白质组学、植物病理、分子遗传等策略,鉴定到一条新的植物免疫代谢通路:PICI1—OsMETS—蛋氨酸—乙烯。证明去泛素化酶PICI1作为一个新的免疫调控蛋白,通过增强蛋氨酸合酶OsMETS的稳定性,促进蛋氨酸介导乙烯代谢通路,参与水稻对抗病原菌的过程中,并且证明该途径是植物协同整合PTI和ETI两层免疫系统的重要策略之一,为水稻抗病育种提供新策略。

值得一提的是,文中几处关键因子的筛选利用了基于质谱组学结果,如蛋白质组学、泛素化等,说明组学技术是筛选关键调控蛋白的重要方法之一。中科新生命能够提供蛋白质组、修饰蛋白质组等多种组学检测服务,欢迎感兴趣的老师前来咨询。

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