项目文章IJROBP | 上海交大附属胸科医院团队利用DIA组学技术发现NSCLC放射敏感性标志物
2022-03-25
中科新生命
1822
局部晚期非小细胞肺癌(LA-NSCLC)患者在临床诊疗中占比相对较高、预后较差且异质性较大，年生存率仅在15%-30%。放疗是LA-NSCLC主要局部治疗手段，然而放疗抵抗严重限制了临床患者整体疗效。因此，寻找放疗敏感性相关标志物及信号通路，为临床个体化治疗提供依据尤为重要。
2021年，上海交通大学附属胸科医院傅小龙教授课题组在International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics（IF 7.038）杂志上发表题目为 "Radiosensitivity-specific proteomic and signaling pathway network of non-small cell lung cancer"的研究成果，利用DIA蛋白组学技术在NSCLC细胞系和临床组织中深入研究NSCLC放射敏感性的潜在分子机制，发现并验证了放射敏感性蛋白标志物。中科新生命为本研究提供了DIA蛋白组学的技术支持。
研究材料
技术路线
· 步骤2：NSCLC患者组织蛋白组分析研究放射敏感性标志蛋白及通路；
· 步骤3：NSCLC放射敏感性蛋白的功能验证；
· 步骤4：NSCLC放射敏感性蛋白临床验证与数据分析。
研究结果
1. 非小细胞肺癌细胞系的蛋白质组学研究
为获得非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系的蛋白质组，作者筛选出29个人NSCLC细胞系，利用DIA蛋白组技术共检测到6876个蛋白质，其中3371个蛋白质在所有细胞中均有表达。3371个共有蛋白的GO和KEGG分析表明，NSCLC蛋白主要富集在代谢和生物合成通路、细菌或病毒感染相关通路以及人类疾病相关的信号通路中。综上，NSCLC的发生可能与细胞代谢、生物合成紊乱以及细菌或病毒感染有关。
图1 NSCLC细胞系蛋白质组学分析
2.NSCLC放射敏感性蛋白及通路筛选
作者通过放射后克隆存活来分析29个人NSCLC细胞系的放射敏感性（SF2），相关性分析找到SF2显著相关的27个放射敏感性蛋白，对27个蛋白进行PPI分析，确定了595个与放射敏感性蛋白相互作用的蛋白。对上述622个互作蛋白的GO和KEGG分析发现，这些蛋白主要与细胞钙粘附素结合、连接酶、蛋白质结合以及各种酶活性有关，主要富集于先前报道的放射敏感性相关信号通路（VEGF、ErbB、HIF-1和EGFR7）。综上，NSCLC的放射敏感性与细胞间的粘附和细胞运动有关。
图2 NSCLC细胞系中与放射敏感性相关的蛋白和通路
3. 组织石蜡样本中放射敏感性蛋白和富集通路分析
为了验证NSCLC细胞系中发现的放射敏感性通路，作者进一步用DIA蛋白组技术检测了12个石蜡包埋的人NSCLC样本，共鉴定出5511个蛋白质。石蜡样本共有的蛋白有2563个，其中1753个在NSCLC细胞系也鉴定到。此外石蜡样本共有的2563个蛋白质的GO和KEGG分析结果与NSCLC细胞系的一致。根据患者的局部无进展生存(LPFS)时间，12例石蜡标本被分为两组：放射响应好(RRG；LPFS≥1.5年)和放射响应差(RRP；LPFS<1.5年)。无监督层次聚类和PCA分析显示RRG和RRP组可以很好地分离。与RRG 相比，RRP组有44个蛋白质差异表达，PPI分析获得1015个放射敏感性相关蛋白。GO和KEGG分析表明，NSCLC细胞系与石蜡样本间有38条与放射敏感性相关的信号通路重叠。重叠的通路中的22个差异蛋白与NSCLC的放射敏感性相关，PPI分析显示，关键的中枢蛋白ILK、IQGAP1和PAK1形成互作网络，该网络中8种蛋白（ILK、IQGAP1、PAK1、IQGAP2、STAT1、STAT5B、HSPA2和Bag2）的表达与SF2呈正相关，表明8种蛋白的高表达可能诱导NSCLC产生放射抗性。
图3 NSCLC石蜡样本中的放射敏感性蛋白和富集途径
4. 放射敏感性相关蛋白在NSCLC细胞系中的表达验证
通过Western blot、免疫荧光和qPCR验证了NSCLC细胞系中差异表达的8个蛋白在放射抵抗细胞中表达水平都增加。为了确定找到的放射敏感性相关蛋白是否在放射抗性中发挥作用，作者对ILK、IQGAP1和PAK1三种关键的中枢蛋白的功能进行了验证，发现单基因敲除的NSCLC细胞中放射诱导的凋亡比例增加，有显著的放射增敏作用。
图4 NSCLC放射敏感性蛋白的表达验证
5. NSCLC患者放射敏感性相关蛋白的验证
为进一步验证放射敏感性相关蛋白在临床患者中的表达，作者选取13例接受根治性放疗的NSCLC患者的石蜡标本，免疫组化显示，6个蛋白ILK、IQGAP1、PAK1、IQGAP2、STAT1和STAT5B在RRP患者中高表达。生存分析显示6个蛋白的表达与接受根治性放疗的NSCLC患者的LPFS相关，证明了这6个蛋白作为放射敏感性标志物的潜力。
图5 放射敏感性蛋白的IHC染色和预后作用
6. NSCLC放射敏感性的信号调控网络
结合前人的研究和本研究结果，作者推测非小细胞肺癌放射敏感性的机制可能与ILK、PAK1和IQGAP1有关：细胞中高浓度的ILK激活IQGAP1，促进IQGAP1-rac1/Cdc42复合物的形成。活化的CdC42诱导PAK1下游效应蛋白的磷酸化。磷酸化的PAK1通过抑制E-cadherin的转录，进一步激活Snail，促进PAK1/Snail复合物的形成，从而诱导EMT和放射抗性。
图6 NSCLC放射敏感性的信号调控网络
小编小结
本研究利用DIA蛋白组学检测技术建立了NSCLC细胞系和肿瘤石蜡组织的蛋白质组图谱，从中发现并验证了非小细胞肺癌放射敏感性特异蛋白，描绘了非小细胞肺癌放射敏感性相关信号通路的图谱网络。本研究不仅加深了我们对非小细胞肺癌放射敏感性机制的理解，筛选到的NSCLC放射敏感性的蛋白标志物也为临床个体化放疗提供了新的方向。
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