Nature（IF 49.962）| 肠菌-免疫：炎症性肠病中真菌菌株多样性的免疫调节作用
2022-04-15
中科新生命
1775
真菌组是肠道微生物组中不可忽视的成员，在包括炎症性肠病（IBD）在内的多种疾病中，都发现了肠道真菌组成的变化。然而，真菌组对宿主健康的影响及其作用机制我们仍然知之甚少。2022年3月美国康奈尔大学Iliev教授等人继于Cell期刊上发表“黏膜真菌通过17型免疫促进肠道屏障功能和社会行为”的研究成果后，再次于顶级学术期刊Nature（IF 49.962）上发表题为“Immune regulation by fungal strain diversity in inflammatory bowel disease”的文章，该研究通过对黏膜真菌多样性测序、培养组学、全基因组测序和免疫反应检测等实验，揭示了溃疡性结肠炎（UC）患者肠道黏膜中优势真菌-白色念珠菌（Ca）的菌株多样性及其对宿主肠道免疫调控的机制和菌株特异性，为研究IBD的疾病机理和治疗方法提供了新视角。
研究材料
结肠黏膜的灌洗液、C57BL/6J小鼠（SPF、GF）、Ca标准菌株和分离株
技术路线
· 步骤1：真菌多样性测序发现UC患者的结肠黏膜中Ca丰度明显增加；
· 步骤2：真菌培养组学结合全基因组测序表明，人肠道Ca具有高菌株多样性，其对免疫细胞的破坏力以及在小鼠肠道中诱导Th17和促炎免疫的能力具有菌株特异性；
· 步骤3：机制上，高免疫细胞破坏力（HD）的Ca菌株通过分泌念珠菌素（受Efg1-Ece1调控）促进肠道炎症，且该作用依赖于IL-1β，阻断其受体IL-1R可在小鼠中减轻疾病；
· 步骤4：患者的Ca菌株诱导免疫细胞损伤和IL-1β表达的能力可反映患者疾病严重程度。
研究结果
1. 发炎肠道中Ca相对丰度大幅增加
对Non-IBD（n=38）和UC患者（n=40）的结肠黏膜灌洗液样本进行ITS扩增子测序，结果显示两组间真菌组成存在显著差异（图1a）。其中，念珠菌属和酵母菌属为优势属，与Non-IBD组相比，UC患者黏膜富集的真菌群中念珠菌属增加，而酵母菌属则显著减少（图1b、c）。培养依赖性实验显示Ca在UC 患者的黏膜中显著增加（图1d）。作者对C57BL/6小鼠进行白色念珠菌SC5314菌株口服灌胃，使用DSS诱导小鼠结肠炎并结合皮质类固醇治疗，来研究Ca定植对肠道炎症的影响。结果显示对照组小鼠仅发展为轻度疾病，但Ca定殖的小鼠表现出增强的组织病理学，包括结肠中黏膜糜烂、隐窝破坏和炎症细胞浸润增加，以及CD4+ T细胞和中性粒细胞浸润增加（图1e-h）。这些结果表明共生的Ca对皮质类固醇治疗下的疾病结果产生负面影响。
图1 Ca在UC患者的结肠粘膜中扩张，并在小鼠结肠炎模型中促进炎症
2. Ca菌株特征影响肠道免疫
肠巨噬细胞是启动和诱导结肠粘膜抗真菌免疫的关键，强毒性Ca菌株则可以损伤这些细胞，而Ca的菌丝形态发生程序是在几种粘膜表面产生毒力因子和发病机制的关键。培养组学实验结果显示肠道Ca分离株可分为两大类：高损伤 (HD-Ca) 和低损伤分离株（LD-Ca），~60%的分离株无论宿主疾病状态如何都形成细丝，且形成细丝的Ca菌株对巨噬细胞的损伤更大（图2a、b）。这些结果表明Ca菌株损伤免疫细胞的能力与成丝能力相关。通过无菌小鼠Ca定植模型评估Ca分离株的免疫反应，结果显示促炎反应与Ca载荷无关，相较于LD-Ca，HD-Ca在结肠中诱导强烈的促炎反应，包括中性粒细胞浸润和Th17细胞诱导（图2d-f），并且加重结肠炎小鼠模型的肠道炎症（图 2h-i ）。因此，特定的人类肠道衍生的Ca分离株诱导Th17细胞和促炎免疫的显著能力是菌株依赖性的，并且与它们造成巨噬细胞损伤的能力直接相关。
图2 肠源性Ca诱导的细胞损伤和促炎免疫是菌株依赖性的
3. 念珠菌素促进肠道炎症
转录因子增强丝状生长蛋白1 (Efg1) 及其相关途径与Ca共生性相关。基于CRISPR-Cas9技术敲除HD菌株EFG1基因后，Ca在肠粘膜过度生长，但其丝状化和细胞损伤能力降低，并导致小鼠结肠中Th17细胞积累显著减少（图3a-d），且两类Ca分离株菌丝粘附/穿透进入肠上皮细胞间无明显差异（图3e）。这些结果表明特定的真菌因子（而非单独的菌丝形态）是导致肠道免疫激活表型的原因。ECE1是编码念珠菌素（菌丝相关毒力因子）的基因，主要受EFG1调控。敲除ECE1基因导致细胞损伤、小鼠结肠中Th17细胞募集和促炎免疫持续减少（图3f-h）。这些结果表明，Ca介导的Th17细胞和促炎性肠免疫是菌株依赖性的，并且HD菌株中依赖Efg1调节的念珠菌素在这一过程中起关键作用。
图3 HD Ca通过Efg1-Ece1依赖因子念珠菌素促进肠道促炎免疫
4. Ca菌株诱导的IL-1β反映了UC的严重程度
对Ca分离株进行全基因组测序，18个分离株位于不同的进化树分枝，表明Ca菌株具有高度遗传多样性。研究发现，IL-1β与特定肠道Ca菌株造成免疫细胞损伤的能力密切相关，Ca菌株诱导巨噬细胞损伤的能力、IL-1β（而非Ca相对丰度）与个体UC患者的疾病严重程度之间存在很强的正相关性（图 4b-e）。这些结果表明菌株的功能特征，而不是真菌组成，能够反映患者的疾病严重程度。IL-1R阻断显著减少了HD-Ca定植小鼠的中性粒细胞募集、Th17细胞积累和结肠炎症（图4g-j），这些数据表明IL-1信号通路在Ca诱导的结肠促炎免疫细胞积累中起关键作用。
图4 患者特异性Ca菌株诱导IL-1β的能力反映了UC疾病的严重程度，抗IL-1R抗体治疗可改善小鼠疾病
小编小结
本研究开发了一个转化平台，用于在真菌菌株和患者特定水平上对真菌生物群进行功能分析。该平台结合了高分辨率真菌生物群测序、真菌培养组学和基因组学、基于CRISPR-Cas9的真菌菌株编辑系统、体外功能性免疫反应性测定和体内模型，能够检查人类肠道中的宿主-真菌间crosstalk。本文发现机会性Ca菌株具有丰富的遗传多样性，这些菌株在炎症性肠病患者的结肠粘膜中占主导地位。人肠道来源的Ca分离株中，具有高免疫细胞损伤能力的菌株反映了UC个体患者的疾病特征，并通过IL-1β依赖性机制在体内加重了肠道炎症。从良性共生到致病状态的转变过程中，HD菌株对利基特异性炎症免疫和产IL-17A的Th17细胞的抗真菌反应依赖于Ca分泌的念珠菌素。这些发现揭示了人类肠道中宿主-真菌相互作用的菌株特异性，并突出了炎症性疾病新的诊断和治疗靶点。
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肠-免疫-靶轴系统研究方案
· 16s/宏基因组----肠道微生物的组成及改变
· 免疫代谢组----肠道微生物产生的用于调控机体免疫的代谢物
· 免疫因子组----肠道微生物如何影响机体免疫
· 转录/蛋白质组----对终端靶器官应对炎症响应机制的系统描述
