Immunity(31.428) | 单细胞转录组+16S揭示肠道微生物或能为机体免疫系统“充电”

肠道微生物群的组成与肿瘤的发展和抗肿瘤免疫的功效有关。匹兹堡大学医学院Timothy Hand教授研究团队在Immunity (31.428)杂志上发表了一篇研究论文，名为“Microbiota-specific T follicular helper cells drive tertiary lymphoid structures and anti-tumor immunity against colorectal cancer”，揭示了带有免疫原性肠道细菌肝螺杆菌（Hhep）定殖结肠肿瘤小鼠，诱导Hhep特异性T滤泡辅助细胞和肿瘤邻近的三级淋巴结构（TLSs）扩张，从而促进抗肿瘤免疫。

研究材料
AOM-DSS模型鼠、AOM-DSS+Hhep小鼠

技术路线
· 步骤1：表型数据分析发现Hhep定殖介导了结肠癌中强大的抗肿瘤作用；
· 步骤2：单细胞转录组分析揭示Hhep定殖增加细胞毒性淋巴细胞的肿瘤浸润并促使TLSs的扩张；
· 步骤3：Tfh 细胞是 Hhep 介导的肿瘤控制和免疫浸润所必需的。

研究结果
1. Hhep定殖重塑结直肠癌肿瘤微环境
前人的研究表明，Hhep菌（一种具有内在免疫原性的肠道细菌）定殖荷瘤小鼠引发的特异性免疫反应可修饰结肠癌微生物群结构，导致抗肿瘤免疫增强。本研究，作者将Hhep菌定殖于生长7周的结直肠癌（CRC）小鼠模型中，相对于对照组（荷瘤小鼠无Hhep菌定殖），Hhep定殖显著减少了肿瘤的数量和大小，延长了小鼠的生存周期。同时，Hhep定殖对肿瘤小鼠的肠道微生物群产生影响，以及肿瘤的免疫细胞浸润增加。以上结果表明，Hhep定殖介导了结肠癌中强大的抗肿瘤作用。

图1 Hhep可降低肿瘤负荷并增加CRC的生存周期

2. Hhep驱动的抗肿瘤免疫
为了更全面的了解Hhep定殖对CRC TME的影响，作者对肿瘤上皮层细胞（epithelial layer,EL）进行单细胞转录组测序，共鉴定出12个细胞簇，Hhep定殖诱导了细胞毒性淋巴细胞（簇1）和效应T细胞（簇5）的增加。其中细胞毒性淋巴细胞包含多种不同的NK细胞和T细胞（CD8⁺、CD4⁺），表达与细胞毒性功能相关的基因（Gzma）。以上数据表明，Hhep定殖增加细胞毒性淋巴细胞的肿瘤浸润。

图2  Hhep定殖导致肿瘤TME的细胞毒性淋巴细胞的增加

3. Hhep定殖促使TLSs扩张
前人的研究表明，Hhep特异性CD4⁺T细胞主要在结肠固有层（ lamina propria,LP）中积累（Chai et al., 2017; Xu et al., 2018），因此作者利用单细胞转录组测序分析了Hhep定殖对LP的影响。聚类分析揭示了表达与基质和内皮细胞相关基因的细胞（簇 1、5、9 和 13）的富集，特别是 Hhep 定殖小鼠中 Ccl21a⁺Lyve1⁺ 淋巴管簇（簇 9、子簇 2）的增加。同时，作者观察到 LP 中淋巴管生成所需基因（Pdpn，Vegfc）的频率增加，荧光显微镜显示 Lyve-1 染色增加。Hhep定殖的小鼠显示肿瘤周围和肿瘤内部的TLSs数量增加，与TLS形成相关的基因表达增加，以上数据表明，Hhep 定殖促使小鼠结肠淋巴网络的扩张。

图3 Hhep定殖扩大了结肠淋巴网络

4. Hhep定殖驱动Hhep特异性CD4⁺Tfh细胞扩增
抗体介导的耗竭实验显示，抗肿瘤免疫不依赖于CD8⁺T细胞，但依赖于CD4⁺T细胞。因此，作者分析了结肠中CD4⁺T细胞对Hhep定殖的反应，流式结果显示，在Hhep定殖后，CD4⁺ T细胞中Tfh细胞（CXCR5⁺PD1⁺CD4⁺ T cells）的百分比持续增加，即在结直肠肿瘤的背景下，Hhep定殖驱动Hhep特异性Tfh细胞扩增。

图4  Hhep定殖驱动Hhep特异性Tfh细胞扩增

5. Tfh细胞是Hhep菌介导的肿瘤控制和免疫浸润所必需的
对TLSs进行FISH染色发现TLSs中含有Hhep菌和Hhep特异性T细胞。为了测试Hhep特异性Tfh细胞在TLS诱导和直接控制CRC中的重要性，作者利用AOM-DSS+Hhep处理Bcl6^fl/flCd4^Cre小鼠（Tfh 细胞缺陷型）诱导CRC证实了Tfh细胞是Hhep驱动的结肠TLS形成、肿瘤的免疫浸润和控制肿瘤生长所必需的。所有数据表明，在CRC动物模型中，Hhep特异性Tfh细胞足以驱动TLS形成、增加免疫浸润并导致肿瘤减少或清除。癌症基因组图谱 (TCGA) 数据库中对CRC患者的分析表明，丰富的Tfh细胞特征通常存在于处于较低肿瘤阶段的患者体内，并且还与更长的无进展生存期相关，因此，在小鼠和人类患者中，Tfh细胞和TLS的存在与更好地控制CRC相关。

图5 Tfh细胞是Hhep菌介导的肿瘤控制和免疫浸润所必需的

小编小结
综上，本文利用最新的单细胞转录组技术联合肠道微生物测序技术，揭示了肝螺杆菌增强了适应性免疫反应，并促使辅助T细胞和产生抗体的B细胞的选择性激活，小鼠结肠肿瘤缩小，延长了小鼠的生存周期。这项开创性研究为利用肠道微生物群治疗（对常规药物和免疫疗法耐药的）结直肠癌肿瘤提供了强有力的证据。

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