项目文章STTT (IF 18) | 上海交大、浙大、陆军军医大利用蛋白组学协力揭示自噬在口腔鳞状细胞癌转移中的机制
2022-05-20
中科新生命
1761
口腔鳞状细胞癌(OSCC)是最常见的口腔恶性肿瘤，其转移是患者预后差的主要原因。自噬可通过减轻各种细胞应激促进OSCC的发展。然而，自噬在OSCC细胞增殖和转移中的作用机制尚不清楚。
2022年4月25日，上海交通大学张志愿教授团队、浙江大学周舟教授团队和陆军军医大学皮会丰教授团队合作在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF 18.187）上发表了题为“NUPR1 promotes the proliferation and metastasis of oral squamous cell carcinoma cells by activating TFE3-dependent autophagy”的研究论文，该研究使用Labelfree定量蛋白组学方法分析显示，核蛋白 1 (NUPR1) 是有或无淋巴转移OSCC患者的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤样本中最显著上调的蛋白，NUPR1 在 OSCC 组织中异常表达，可能与 OSCC 患者的总体存活率较低。此外该研究使用TMT标记定量蛋白组学方法分析显示NUPR1通过直接增加转录因子E3 (TFE3)活性来维持自噬流和溶酶体功能，进而促进 OSCC 细胞增殖和体内外转移。本研究中NUPR1-TFE3介导的自噬过程为靶向OSCC进展的药物治疗提供了潜在的治疗靶点。中科新生命为本研究提供了Labelfree非标记定量蛋白组学和TMT标记定量蛋白组学的技术支持。
研究材料
有和无淋巴转移的OSCC的FFPE样本、Cal27和HN6癌细胞系、OSCC组织和正常粘膜组织
技术路线
· 步骤1：Labelfree蛋白组学分析发现NUPR1在有淋巴转移的OSCC的FFPE样本中显著上调；
· 步骤2：NUPR1与患者的OSCC进展及不良预后呈正相关；
· 步骤3：蛋白组学揭示自噬在NUPR1介导的OSCC进展中发挥重要作用；
· 步骤4：NUPR1的敲低阻断了OSCC细胞中的自噬流；
· 步骤5：NUPR1的敲低不抑制OSCC细胞自噬体的形成和成熟；
· 步骤6：NUPR1敲低不影响OSCC细胞中的自噬体-溶酶体的融合；
· 步骤7：NUPR1的敲低抑制了OSCC细胞中溶酶体的功能；
· 步骤8：TFE3负责OSCC细胞中NUPR1介导的自噬溶酶体过程；
· 步骤9：在体外和体内，NUPR1通过激活TFE3依赖的自噬促进OSCC的进展。
1. Labelfree蛋白组学分析发现NUPR1在有淋巴转移的OSCC的FFPE样本中显著上调
作者首先对来自有淋巴转移（LNM）和没有淋巴转移(non-LNM)的OSCC患者的FFPE肿瘤样本（分别为10个样本）进行了Labelfree非标记定量蛋白组学分析（图1a）。此次共鉴定到3021个蛋白，LNM vs non-LNM组的比较分析显示208个蛋白显著上调，其中NUPR1蛋白是上调倍数前五的蛋白（图1c）。
图1 Labelfree非标记定量蛋白组学分析
2. NUPR1与患者的OSCC进展及不良预后呈正相关
为验证蛋白组学的结果，作者采用IHC的方法进行了NUPR1的组织芯片（TMA）实验，结果表明NUPR1表达水平在OSCC组织中(n = 88)相较于正常粘膜组织(n = 20) 显著增加（图2a和2c）。NUPR1表达水平与临床病理特征的关联分析表明NUPR1与OSCC转移呈正相关（图2b、2d和2e）。此外，Kaplan-Meier生存分析显示NUPR1高表达的OSCC患者总生存率较低(图2f)。
为了进一步阐明NUPR1在OSCC进展中的作用，作者在高表达NUPR1的OSCC细胞系（Cal27和HN6癌细胞系）中将NUPR1敲除。集落形成实验显示，NUPR1敲低后显著降低了OSCC癌细胞的集落形成效率（图2g）。伤口愈合和Transwell侵袭实验结果表明NUPR1敲低的癌细胞迁移和侵袭能力明显受到抑制（图2h-2j）。综上所述，NUPR1 敲低有效地抑制了OSCC的进展，表明了NUPR1与OSCC的进展的正相关性。
图2 NUPR1与OSCC进展及不良预后呈正相关
3. 蛋白组学揭示自噬在NUPR1介导的OSCC进展中发挥重要作用
为了揭示NUPR1在OSCC进展中的潜在机制，作者采用TMT标记定量蛋白组学的方法检测了NUPR1敲低的Cal27癌细胞和对照组细胞间的蛋白变化。比较分析显示与对照组相比，NUPR1敲低的Cal27癌细胞中27个蛋白显著上调、28个蛋白显著下调（图3a）。差异蛋白的KEGG通路富集分析表明，自噬通路显著富集(图3b)，这意味着自噬可能在NUPR1介导的OSCC进展中发挥重要作用。
图3 自噬在NUPR1介导的OSCC进展中发挥重要作用
4. NUPR1的敲低阻断了OSCC细胞中的自噬流
为验证NUPR1的敲低是否影响OSCC细胞中的自噬流，作者分析了自噬体形成的标志物MAP1LC3B-II（微管相关蛋白轻链3）的变化，结果显示在Cal27和HN6癌细胞将NUPR1敲低后，MAP1LC3B-II表达水平均增加（图4a和4b），以及SQSTM1（选择性自噬接头蛋白）的表达水平也明显增加（图4a和4b）。然而在癌细胞中将NUPR1敲低同时加入氯喹(CQ)（自噬以及自噬流的抑制剂）时，NUPR1敲低诱导的MAP1LC3B-II的表达增加不受影响(图4c和4d)。综上所述，在OSCC细胞中，NUPR1的敲低可抑制自噬流。
图4 NUPR1的敲低阻断了OSCC细胞中的自噬流
5. NUPR1的敲低不抑制OSCC细胞自噬体的形成和成熟
由于自噬是一个动态循环系统，具有多个步骤（①自噬泡的形成②Atg5-Atg12-Atg16L复合物形成并与自噬泡融合③微管相关蛋白轻链3（LC3）与自噬泡结合形成自噬体④自噬体捕获需降解或清除的蛋白质等物质⑤自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体、内容物降解），作者进一步研究了NUPR1敲低在早期或晚期诱导的自噬抑制作用。研究发现ATG5 沉默降低了NUPR1敲低诱导的Cal27和HN6细胞GFP-LC3（自噬体的特异性标记物）的增加（图5a和5b），也降低了MAP1LC3B-II的积累（图5c和5d），表明NUPR1的敲除不影响自噬体的形成。多泛素蛋白聚集物是成熟自噬体的重要组成部分，其形成是由SQSTM1介导的，作者通过评估GFP-LC3与SQSTM1的共定位来评估自噬小体的成熟。结果表明NUPR1的敲低并不促进OSCC细胞中自噬体的成熟（图5e和5f）。
图5 NUPR1的敲低不抑制OSCC细胞自噬体的形成和成熟
6. NUPR1敲低不影响OSCC细胞中的自噬体-溶酶体的融合
自噬体与溶酶体的融合是自噬降解的一个基本过程，研究发现在Cal27和HN6细胞中，自噬体标记物GFP-LC3和溶酶体标记物LAMP2的共定位比例不受NUPR1敲低的影响（图6）。
图6 NUPR1敲低不影响OSCC细胞中的自噬体-溶酶体的融合
7. NUPR1的敲低抑制了OSCC细胞中溶酶体的功能
为了研究NUPR1的敲低是否抑制了溶酶体的功能，作者检测了溶酶体标志物LAMP1和LAMP2的表达水平。结果表明，在Cal27和HN6细胞中，NUPR1的敲低抑制了LAMP1的表达，但不抑制LAMP2 (图7e和7f)。此外，在NUPR1敲低的OSCC细胞中，溶酶体蛋白水解活性明显受到抑制(图7g)、溶酶体绿色荧光探针的荧光强度也显著降低（图7h）。综上所述NUPR1敲低对自噬流的阻断可能是通过抑制OSCC细胞内溶酶体功能来介导的。
图7 NUPR1的敲低抑制了OSCC细胞中溶酶体的功能
8. TFE3负责OSCC细胞中NUPR1介导的自噬溶酶体过程
为了阐明NUPR1影响自噬溶酶体的潜在机制，作者使用蛋白质组学方法分析NUPR1敲低的Cal27细胞和对照组的显著差异蛋白，结果表明NUPR1的敲低显著降低了TFE3的表达水平，western blot实验进一步验证了该结果（图8a和8b），PCR实验也证实了自噬流中涉及的“TFE3应答基因”的表达变化（图8c和8d），综上表明NUPR1在自噬溶酶体事件中发挥的关键作用可能与TFE3有关。
已知NUPR1是调控基因转录的重要转录因子，故作者采用荧光素酶报告基因的方法检测NUPR1与TFE3的关系，结果表明在OSCC进展中，NUPR1是通过增加TFE3启动子活性和激活TFE3转录来维持自噬流的（图8e和8f）。
图8 NUPR1在自噬溶酶体事件中发挥的关键作用与TFE3有关
此外， TFE3的过表达可以显著挽救NUPR1敲低对Cal27和HN6细胞溶酶体功能的损伤（图9a-9d）,也显著降低了NUPR1缺失的OSCC细胞中MAP1LC3B-II和SQSTM1的积累(图9e和9f)。
图9 TFE3过表达可挽救OSCC细胞中NUPR1 减少引起的自噬流的抑制
9. 在体外和体内，NUPR1通过激活TFE3依赖的自噬促进OSCC的进展
为了探究TFE3在NUPR1敲低介导的OSCC细胞进展中的影响，作者展开了一系列的体外实验，结果表明TFE3的过表达部分逆转了NUPR1 敲低介导的OSCC细胞迁移和侵袭的抑制作用(图10a-f)。
图10 TFE3的过表达可拮抗NUPR1 敲低诱导的OSCC细胞增殖和转移抑制
此外，体内实验发现NUPR1敲低导致接种于裸鼠皮下的Cal27细胞形成的肿瘤的体积和重量明显减少（图11a-11c）。也导致了转移性结节形成和生长的抑制（图11d）。同时，NUPR1敲低有效地抑制了异种移植瘤模型中TFE3和“TFE3应答基因”的表达(图11e)。在对转移性结节的评估中也得到了同样的结果（图11f）。综上所述，NUPR1敲低对OSCC进展的抑制依赖于TFE3活性的抑制。
图11 NUPR1的敲除抑制了裸鼠OSCC的侵袭性
小编小结
在本研究中，作者首次证明了(Ⅰ)通过对有淋巴结转移和无淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌 (OSCC)组织FFPE样本的蛋白组学分析发现了NUPR1是一种关键蛋白，在LNM患者中显著增强，且与OSCC转移和不良预后呈正相关。(Ⅱ)溶酶体功能障碍而非其他关键步骤的破坏(自噬体形成或成熟，自噬体-溶酶体融合)是NUPR1 敲低诱导的自噬流受损和OSCC细胞增殖和转移抑制的关键原因。(Ⅲ)在OSCC进展中，NUPR1通过增加TFE3启动子活性和激活TFE3转录来维持自噬流。这些发现为细胞癌进展中NUPR1-TFE3依赖的自噬的潜在治疗靶点拓宽了新的见解。
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