10×单细胞转录组常见Q&A（一）| 实验开展前最需要了解的几大问题

单细胞测序作为近几年是炙手可热的技术之一，各位老师在使用这项新技术的时候，难免会有各种疑问。接下来小编整理了一些初期经常遇到的问题，分享给各位，希望可以为打算开展单细胞实验的老师答疑解惑。

Q1：如何规划我的第一个单细胞实验？

在早期规划阶段，您要考虑的因素很多，但样本制备是一个重要的起点。您需要考虑的因素之一是处理的样本类型。是组织、细胞悬液，还是全血？是否需要解离、富集或纯化步骤？此外，您还要考虑每个实验条件所需的样本数量，以及是否需要生物学重复。缩小到单个样本，您应当考虑每个样本需要多少个细胞才能获得所需的结果，这也将为后续的样本富集、纯化和质控方法提供信息。

图1 单细胞实验流程

Q2：单细胞测序是否需要生物学重复？

由于存在遗传和环境因素的影响，个体间会存在差异，因此实验设计需要引入生物学重复消除该差异。近年来，单细胞测序文章对生物学重复的要求也越来越高，例如人的样本，其异质性很高，建议每组尽量保证5个样本的生物学重复。而动物模型的样本也尽量保证每组3个生物学重复。

Q3：每个样本需要多少个细胞？

目前，对单细胞悬液需要先进行质检和计数，一般要求细胞数目≥5万，细胞存活率≥ 80%，将检测合格的细胞经洗涤、重悬制备成合适的细胞浓度 700~1200 cells/ul，以备进行 10x Genomics Chromium™ X系统上机操作。

中科搭载10×Genomics最新的单细胞仪器平台Chromium X有16个通道，每个通道最多可以捕获2万个单细胞。通常每个样本捕获6K-1w的细胞数目就可以基本满足实验分析需求。是否需要更大的细胞量，还是需要根据老师实验目的来决定。

图2 Chromium X芯片及细胞捕获示意图

Q4：单细胞测序为何要选择10×Genomics？

在目前群雄逐鹿的单细胞市场中，为什么我们要选择10×Genomic，原因如下：

A：10×Genomics单细胞技术助力科学家发表的文章数量遥遥领先。这也反映出广大科研工作者对于10X平台的认可度远高于其他单细胞平台以及10X单细胞结果的稳定性、可靠性以及客观性。

图3 10×Genomics文章数量

B：更加全面的应用，满足科研工作者单细胞多组学的需求。从单细胞转录组联合空间组学，单细胞转录组联合代谢组学以及单细胞转录组联合蛋白组学等多维度多角度阐述表型发生过程中的细胞和分子调控机制。

图4 10×Genomics多组学产品图

C：更高的通量，更低的成本。纵观单细胞测序文章，测得的细胞量越来越多，10×推出的Chromium X可实现一次上机拿到上百万个单细胞；而Fixed RNA试剂盒，可以将单细胞样本进行固定，通过多批次混样，降低单个样本的成本。

图5 10×Genomics优势图

Q5：样本类型不适合运输怎么办？

中科的单细胞实验团队可以为老师提供上门消化上机服务。无论时间，无论地点，仅需老师与我们提前预约，并确定老师能提供实验所需仪器后，即可上门完成样本的消化和上机实验。

图6 客户自备仪器和试剂清单

Q6：细胞类型如何进行注释？

通常我们细胞类型注释有两种思路，一种是利用软件自动注释，如SingleR 等，但一般自动注释的结果只能作为参考；二是基于文献或者数据库进行人工注释，专业的人工注释通常被认为是细胞注释的金标准，但其过程是极为耗时和缓慢的，并可能是主观的。中科可以提供以上两种不同的注释方法给老师来选择！

图7 合作客户细胞注释图