单细胞测序专题 | monocle2拟时序分析前后结果不一致？带您认识一款新的分析软件PAGA
2022-08-16
中科新生命
1957
通过单细胞转录组测序技术得到海量细胞的表达矩阵，可以对细胞亚群做聚类、注释，鉴定亚群marker genes，寻找组间差异调控网络，绘制组织特异性图谱等。在聚类分析中寻找的是细胞间的离散属性，也就是细胞之间的不同，而轨迹分析中寻找的是连续属性，也就是细胞之间的相同之处。为什么细胞的分化既有离散性又有连续性呢？这是一个问题，实际检测是针对每一个细胞进行的，但是细胞的分化是连续的，之所以用分群的方法来解释异质性，然后用轨迹来阐述发育轨迹，实在是一种无奈之举，只能说现实总是残酷的。
目前进行细胞轨迹分析的方法和软件非常之多，常见的轨迹分析主要是通过monocle软件为代表的拟时序分析（pseudotime analysis）。事实上monocle提供了一套具有启发意义的轨迹方法，通过简单粗暴的方式试图弥补这理想与现实的间隙。在monocle软件里轨迹与图谱是分离的，即TSNE/UMAP的图谱以及另一个降维空间的轨迹。那么有没有一种降维技术能够把两者结合起来呢？今天我们介绍的scanpy的PAGA(graph abstraction reconciles clustering with trajectory inference through a topogy preserving map of single cells)寄希望在保留细胞图谱的基础上完成细胞轨迹的推断，从而在聚类核轨迹上实现了统一。
图1 基于分区的图抽象生成保留拓扑的单细胞映射
PAGA可以被看作是一种易于解释和稳健的拓扑数据分析方法，通过高维基因表达数据降维后计算邻域关系的相关距离度量来表示kNN图。将kNN图以期望的分辨率进行分区，其中分区表示连续的细胞群（partitions represent groups of connected cells）。为此，可以使用Louvain算法，当然也可以通过其他方式进行分区。接下来，PAGA图通过将一个节点与每个分区关联起来，并通过分区间连同性的统计度量的加权边连接每个节点。然后，通过丢弃低权重的假边，PAGA图揭示了数据在选定分辨率下的去噪拓扑，并揭示了其连接和断开的区域。是不是感觉很绕，简单来说就是，点代表一个细胞类群，两点之间的连线代表两个细胞类群之间有关系，线的长短反映两个细胞类群在聚类图上的位置关系（请选择忽视），线的粗细表示得到的轨迹关系的置信度（请选择重视），线越粗，置信度越高。 接下来，我们一起来看看scanpy中PAGA的效果怎么样吧。 最近，Plass等人利用PAGA对来自21,612个细胞的scRNA-seq数据重建了整个成年动物的细胞谱系。作者研究了使整体连通性最大化的树状子图（通过逆PAGA连通性加权的G∗的最小生成树），同时，作者还展示了如何将PAGA用于生成具有多种分辨率的数据映射图。同流形学习（连接的组织类型以断开或重叠的形式出现）相反，每个映射都保留了数据的拓扑。PAGA的多分辨率功能直接解决探索性数据分析，特别是对于单细胞数据：需要更高细节的区域重新聚类。
图2 PAGA应用于整个扁虫的图谱
尽管PAGA图中的连接通常对应于实际的生物轨迹，但情况并不总是如此。这是PAGA应用于kNN图的结果，它只包含关于数据拓扑的信息。因此，我们不禁思考，既然每个生命从长远来看所有的细胞都来自一个细胞，是不是在一套数据集中可以设置一个遥远的点作为发育的起点呢？这样是不是更能反映轨迹推断的实际呢？ 因此，有人考虑基于RNA速率的有向图，用于存储有关细胞转变的信息。为了实现这一目的，我们将无向的PAGA连接性度量扩展到此类有向图，并使用它来定向PAGA图中的边。由于高维特征空间scRNA-seq数据的特殊性，直接拟合RNA速率向量是很困难的。 PAGA是否能够提供了一种可以提取拓扑信息和RNA速率信息的方法？ 接下来，通过对Wagner等人的斑马鱼数据进行分析，将PAGA用来分析斑马鱼胚胎在不同发育时间点收集的53,181个细胞。PAGA图准确地获取了时间进展的链拓扑，并且更容易解释的细胞类型谱系关系。通过对PAGA坐标初始化ForceAtlas2布局自动产生的单细胞数据。将精细细胞类型的PAGA图与的粗线度图进行比较，再现了作者之前的结果。
图3 PAGA应用于斑马鱼胚胎数据
小编小结 scRNA-seq近些年的发展对生物医学研究领域产生极大的影响。由此产生的数据集也是海量的，然而，对这些景观（landscape）数据反映细胞异质性和模式的算法分析，仍然面临着巨大的挑战。目前的计算方法通常以如下两种方式之一来解决这一点 ：细胞聚类和细胞轨迹分析。虽然前者是大多数单细胞数据分析的基础，而后者可以更好地解释连续表型和过程。PAGA基于图形的分析方法把这两种分析思路进行了统一，先通过Louvain algorithm算法对细胞进行降维，生成低纬度的聚类图，基于聚类图进一步分析不同细胞类群之间的关系。所以，与其说PAGA是轨迹分析图，不如说是轨迹关系图。
