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10×单细胞转录组常见Q&A(二)|实验质控相关

2022-09-07

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各位老师大家好!新一期10×单细胞转录组常见Q&A又来了!上一期中,我们介绍了单细胞实验开展前最需要了解的几大问题(点击阅读)。这一期,我们将为大家介绍单细胞实验环节中的质控细节。


1.    transcriptional bursting

首先,给大家介绍转录表达中的一个现象:转录爆发(Transcriptional bursting),是指基因会从沉默的状态突然切换为激活态,启动转录、并在短时间内(通常不超过2-3min)急剧生成产生大量RNA;然后再次进入沉默的状态。

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图1 显微镜下转录爆发现象的示意图


我们都知道,基因的转录和表达是有周期性的。当基因的转录被激活时,mRNA的水平会突然上升,然后慢慢下降,而相应的蛋白水平的变化会有一定的滞后。这种周期的频率,以及每次波动的大小,在RNA分析中都会影响最终的表达量(可以是FPKM值、RPKM值)。这种周期性的转录现象,就是同transcriptional bursting有关。


2.    单细胞实验整体流程

在bulk RNA测序过程中,由于RNA提取、反转录和PCR扩增流程,会存在偏好性的问题。同样的,单细胞转录组实验中也存在偏好性,如扩增、Drop-out rates(有部分高表达的mRNA 无法被扩增出来)、Transcriptional bursting、背景噪音、细胞周期与细胞大小、以及批次效应带来的偏好性。

单细胞实验整体流程如下图,接下来给大家详细讲解一下哪些实验环节会带来偏好性,以及如何发现和质控。

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图2 单细胞实验整体流程图


2.1 细胞分离

我们在做单细胞测序的时候,首先要做细胞分离。细胞分离必须要在较短时间内完成,否则会影响到细胞的状态,甚至可能导致RNA从细胞中漏出。

从组织中分离出单细胞可能遇到的问题:

²  细胞分离的不彻底,存在多个细胞黏连到一起的情况;

²  细胞分离条件对所有细胞类型不适中,会对一些细胞造成损伤,使RNA溢出;

²  溢出的RNA,导致了背景信号;

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图3 细胞分离时注意问题

 

细胞分离过程可能会产生偏好性。例如分离出的细胞可能只是一些特定细胞。因此对于聚类的结果,要进行仔细检查,以发现某一群细胞中特异表达的基因是否存在着会由细胞分离实验所引起的高表达基因。中科有着专业的实验团队,可以选择最优的细胞分离方案,在保证细胞活率大于80%的同时,降低偏好性的影响。

 

2.2 细胞分选

在做细胞分选的过程中会遇到如下的问题:

²  现有的单细胞测序都会遇到有些drople可能是空的或者存在多个细胞;

²  对于细胞的类型也往往存在偏好性,如中性粒细胞等;

²  分选实验持续时间过长会损害细胞,造成背景噪音;

因此,选择合适的单细胞测序策略尤为重要。Chromium X相较之前的型号,额外增加了温控系统,可以使整个系统始终在恒定条件下运行,降低批次效应,提高数据质量。通过微流控系统将单个细胞与Gel Beads结合形成GEMs,细胞捕获率65%,双细胞捕获率为0.4%/1000个细胞,上机一次运行的时间不超过18min。

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图4 Chromium X细胞分选

 

2.3 细胞裂解

在做单细胞测序之前,需要对GEMs中细胞进行裂解。不同的细胞组织,裂解条件也会不一样,如果裂解条件过于严格,就会影响文库制备。中科单细胞实验团队会根据不同细胞类型选择合适的裂解条件,确保后续文库制备正常。

 

2.4 反转录和PCR扩增

在GEMs中细胞裂解后经反转录(RT),形成10×Bacoded cDNA,

再进行PCR扩增,质控要求cDNA总量>100ng(浓度>2.22ng/μl),片段分布在500bp-3000bp。由于不同细胞的扩增条件是不同的,但是在单细胞在扩增时的扩增条件单一,必然就会使得不同细胞的扩增效率存在不同,此外,PCR本身循环扩增过程中也会存在bias。但得益于Gel Beads中的UMI(对基因绝对定量),无论基因被扩增多少次,只对UMI计数一次,这消除了PCR扩增带来的偏好性。

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图5 10×单细胞流程

 

2.5 文库构建和测序

对构建好的单细胞文库进行质检,文库浓度一般比cDNA浓度高出10倍以上。片段分布在300-600bp,主峰落在450bp左右。最后将质检合格的文库上机测序,整个单细胞实验环节到此就结束了!

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图6 单细胞文库质检峰图

 

总结

相信大家阅读完以上内容,已经对单细胞测序整体实验流程的质控细节有一定了解了。下一期会给大家带来分析环节的质控内容,敬请期待!



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