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N端测序

——即蛋白质N端氨基酸序列分析技术服务

“Edman降解,蛋白质化学的经典方法,氨基酸序列分析的金标准之一。”


Edman降解法是异硫氰酸苯酯(PITC)在弱碱(TMA)条件下与蛋白质N端α-氨基偶联生成苯氨基硫甲酰肽(PTC-蛋白质),然后在无水强酸(TFA)条件下,N端的第一个残基从完整的多肽、蛋白链上以2-苯氨基噻唑啉酮(ATZ-AA)的形式裂解下来,之后在稀酸(25% TFA)条件下,ATZ-AA转化为更加稳定的苯基乙内酰硫脲衍生物,即PTH-氨基酸,生成的PTH-AA输送至高效液相色谱中进行在线分析,剩下的多肽蛋白样品可反复进行上述处理,依次生成各种PTH-AA,经液相系统色谱柱分离可以确定被测多肽蛋白质供试品N端的氨基酸排列顺序。


技术流程

技术特点

  最经典的蛋白质氨基酸测序方法

  可靠性最高的测序方法

■  对蛋白质多肽样品的纯度要求很高

■  非标准氨基酸无法测定

分析应用

“Edman降解法N端测序在未知蛋白的测序方面发挥不可替代的作用。”

蛋白质的生物合成均起始于N端,其N端序列的组成对生物学功能有着巨大的影响,例如蛋白质的半衰期、蛋白质在亚细胞器中的定位等等。并且N端可发生多种翻译后修饰,这些也与蛋白质的功能和稳定性息息相关。因此,对于蛋白质N端序列的分析,有利于帮助分析蛋白质的高级结构,揭示蛋白质的生物学功能。并且随着现代医药工业的发展,出现了大量的蛋白质和多肽类药物分子,对这些蛋白质多肽类药物分子N端序列的分析确认也是医药工业质量控制的重要环节。

技术指标

■  样品要求:

     纯度不低于95%;蛋白质样品N端未封闭;提供样品的相对分子质量;样品含量不低于10 μg。

■  仪器设备:

           全自动蛋白仪·多肽N端测序仪(SHIMADZU型号:PPSQ-33A)

■  分析软件:

           PPSQ-30-Analysis、PPSQ-30-Data processing

           色谱柱(WAKO型号:Wakosil-PTH (4.6 mm*250 mm))

■  实验原理:


Edman降解法原理图

案例分析

      案例一:抗体类蛋白质的轻重链分析和N端氨基酸序列测定

样品名称:XXXXXXX理化测定对照品

批号:XXX-XXX-XXXX-X

样品状态:PVDF膜(抗体)

样品重链理论序列为:NH2-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X

谱图结果:


     

案例二:未知序列蛋白质类样品的N端氨基酸序列分析

样品名称:未知

样品状态:PVDF膜

样品理论序列:未知

谱图结果:

Q&A

1)    N端测序仪的介绍。

多肽蛋白质N端测序仪生产制造商主要有美国ABI公司和日本SHIMADZU公司。两家公司的仪器均是基于Edman降解原理进行N端测序,只是在后续的PTH-AA色谱分离条件方面存在差异。随着后来ABI公司逐渐退出N端测序仪市场,相应的仪器也已停产,使得SHIMADZU公司现在成为N端测序仪方面的主要制造商,其主要的N端测序仪型号为:PPSQ-33A、PPSQ-31A。

2)    Edman方法和质谱方法的比较介绍。

Edman降解法和质谱分析方法作为现有主要的蛋白质样品N端分析方法,有其各自的优缺点。Edman降解法作为现有蛋白质样品N端序列测试的黄金标准,已得到广泛应用,但还是存在不足之处,其通量较低,每个残基测试需花费45分钟时间,且每个残基测试的费用成本较高,对于N端封闭的蛋白质样品无法直接进行N端测序。

质谱法分析作为蛋白质样品N端分析的另外一种手段,其通量高,成本相对较低,对N端封闭样品可以进行测试,但其对于未知序列的蛋白质难以做出正确判断,且无法区分分子量相近的氨基酸(I/L、Q/K),所以两种方法蛋白质样品N端测序过程中可以相互进行补充。

3)    N端氨基酸测序的样品准备过程。

PVDF膜蛋白质样品可直接进行N端测序。N端测序对样品纯度要求较为严格,如果样品纯度低于95%需进行电泳分离纯化,之后电转印至PVDF膜上进行N端测试。如果样品纯度高于95%,可进行简单处理后进行N端测试,处理过程为:液体样品可直接通过prosorb转移至PVDF膜上,固体样品用0.1% TFA溶液溶解后用相同方法亦转移至PVDF膜上,之后切取样品膜进行测试,如为小肽样品或测试循环数较多(>20)需进行样品固定处理。

   
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