定量泛素化蛋白质组分析

研究背景

泛素化是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下,将细胞内的蛋白质分类,从中选出靶蛋白分子,并对靶蛋白进行特异性修饰的过程。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system, UPS)介导了真核生物80%~85%的蛋白质降解,该蛋白质降解途径具有依赖ATP、高效、高度选择性的特点。除参与蛋白质降解之外,泛素化修饰还可以直接影响蛋白质的活性和定位。由于泛素化修饰底物蛋白在细胞中的广泛存在,泛素化修饰可以调控包括细胞周期、细胞凋亡、转录调控、DNA损伤修复以及免疫应答等在内的多种细胞活动。

◆ 分析流程

样品经Trypsin酶切,酶切产物由泛素化特异性抗体(Cell Signaling Technology 5562S)进行泛素化肽的富集,富集后由高精度质谱Q ExcativeThermo Scientific)分析,分析数据由生物信息学软件进行数据检索(图1)。

Figure 1.  Workflow of identifying ubiquitin sites

◆ 实例分析

1)    样品

 组织样品

2)    Trypsin酶切

 样品采用溶液内酶切方法酶切[1]

3)    泛素化肽的富集

 采用泛素化特异性抗体选择性富集泛素化肽段的方法[2]

4)    仪器

 质谱仪:Q ExactiveThermo Scientific,高性能四极杆的母离子选择性与高分辨的准确质量数(HR/AMOrbitrap检测技术相结合,分辨率高达140,000

纳升级高效液相色谱:Easy nLC1000Thermo Scientific

色谱柱:0.075MM*250MM3μm RP-C18

Trap柱:0.1MM*20MM5μm RP-C18 Thermo scientific EASY column

Figure 2.  Easy nLC1000 and Q Exactive

5)    数据分析

 数据由MaxQuant 1.2.2.5[3][4]分析,过滤参数 peptideprotein FDR≤0.01,并计算Ubiquitin-peptides score and Probabilities[3][4]

 

◆ 实验结果

1)     鉴定结果

 实验共鉴定到1805个蛋白质,其中949个是泛素化蛋白质,共鉴定到1505个泛素化肽,1519个泛素化位点。图3为某泛素化肽段的MS/MS图谱,表1为泛素化肽段鉴定结果。

Figure 3.  MS/MS of Ubiquitin-peptides


Table 1.  Identification of Ubiquitin-peptides

Protein

Score

Modified sequence

GlyGly (K) Probabilities

A2WMG6

108.53

AAAAEFLK(gl)SFNK

AAAAEFLK(0.999)SFNK(0.001)

B8AF09

101.72

AAIKEEAEGK(gl)LK

AAIKEEAEGK(0.995)LK(0.005)

A2XUU7

127.22

AASFNIIPSSTGAAK(gl)AVGK

AASFNIIPSSTGAAK(0.999)AVGK

A2WLG6

81.338

LPPPEPK(gl)KPK

LPPPEPK(0.921)K(0.069)PK

A2WKD5

126.71

AEVK(gl)KPEVK

AEVK(0.999)K(0.001)PEVK

A2WKD4

108.57

AEVNK(gl)PEVK

AEVNK(1)PEVK

A2WL58

69.122

AKDDLIGDVVAVDGLIK(gl)PPR

AKDDLIGDVVAVDGLIK(1)PPR

A2WLV8

90.714

ASK(gl)VLEQLSGQSPVFSK

ASK(1)VLEQLSGQSPVFSK

A2WKR5

98.04

ATAK(gl)STGIEGR

ATAK(1)STGIEGR

B8BFV2

84.566

DGGSDYLGK(gl)GVSK

DGGSDYLGK(0.984)GVSK


Table 2. Identified Ubiquitin-peptides of three experiments






Triplicate Enrichment

A1

A2

A3

Identified Ubiquitin-Peptides

1394

1359

1390

Total Identified Peptides

3305

3354

3220

Enrichment Proportion

42.17%

40.52%

43.17%


2)     泛素化位点分析重复性

       我们采用三次技术学重复实验,三次实验中实验A1鉴定到1394个泛素化肽段,实验A2鉴定到1359个泛素化肽段,实验A3鉴定到1390个泛素化肽段(表2)。80.79%的泛素化肽段(1216 of 1505)出现在三次实验中,13.69%的泛素化肽出现在两次实验中,5.51%的泛素化肽(83 of 1505)出现在一次实验中(图4)。说明三次实验间的相关性好,鉴定的泛素化肽段数量稳定。

Figure 4.  Venn Diagram of three experiments

 

3)     重复相关性分析(Pearson Correlation

       由Basepeak图可见,三次实验Basepeak图具有较高的相似性(图5)。我们用MaxQuant软件分别对泛素化蛋白和泛素化肽段的强度进行分析,计算三次试验之间的pearson相关系数,发现R值均大于0.9(图6,图7),说明三次实验重复性较好[5]



Figure 5.  Basepeak of three experiments



Figure 6.  Reproducibility of Ubiquitin-peptide identification between three experiments

 ◆ 实验结论

1)     总共鉴定到1505个泛素化肽段,其中80.79%的泛素化肽段(1216 of 1505) 出现在三次实验中。

2)     MaxQuant软件对泛素化肽的强度进行分析,计算三次试验之间的pearson相关系数,发现R值均大于0.9

3)     结论:将泛素化特异性抗体富集技术和高精度串联质谱技术相结合,可以进行大规模的泛素化位点鉴定和修饰定量分析,并具有较好的重复性,在泛素化蛋白质组学的研究中具有很好的应用前景。

 

◆ 参考文献

[1]       Guo A, Gu H, et al. Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation. Mol Cell Proteomics. 2014; 13(1): 372-87.

[2]       Tong Z, Kim MS, et al. Identification of Candidate Substrates for the Golgi Tul1 E3 Ligase Using Quantitative diGly Proteomic in Yeast. Mol Cell Proteomics. 2014; 13(8): 1979-92.

[3]       Olsen JV, Blagoev B, et al. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell. 2006; 127(3): 635-48.

[4]       Cox J, Mann M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 2008; 26(12): 1367-72.

[5]       Lundby A, Secher A, et al. Quantitative maps of protein phosphorylation sites across 14 different rat organs and tissues. Nat Commun. 2012; 3: 876.


   
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