定量乙酰化蛋白质组分析

研究背景

蛋白质的乙酰化修饰是在乙酰基转移酶的作用下,蛋白质的赖氨酸残基上添加乙酰基的过程,是细胞控制基因表达、蛋白质的活性或生理过程的一种机制。乙酰化修饰功能主要集中在对细胞染色体结构的影响以及对核内转录调控因子的激活方面 。近年来,通过高通量的蛋白质组研究和不同物种的代谢通路研究发现,在生理状况下,存在着大量非细胞核的蛋白质被乙酰化修饰,具有广泛的生物学意义。

(1)       乙酰化修饰普遍存在于人体的代谢酶之中,具有调节代谢通路及代谢酶的活性。

(2)       乙酰化对代谢的调控在生命进化过程中极为保守,广泛存在于从低等原核细胞到包括人在内的高等哺乳动物的翻译后修饰过程中。

(3)       蛋白质的乙酰化具有很高的功能特异性,与肿瘤等疾病密切相关,为开发代谢类疾病的药物研发提供了重要依据和全新思路。

 ◆ 分析流程

样品经Trypsin酶切,酶切产物由乙酰化特异性抗体(Cell Signaling Technology 13416S)进行乙酰化肽段的富集,富集后由高精度质谱Q ExactiveThermo Scientific)分析,分析数据由生物信息学软件进行数据检索(图1)。


Figure 1. Workflow for identification of lysine acetylation sites

◆ 实例分析

1)         样品

       两组细菌样品,A为对照组样品,B为处理组样品,分别进行三次技术学重复实验。

2)         Trypsin酶切

       样品采用溶液内酶切方法酶切[1]

3)         乙酰化肽段富集

       采用乙酰化特异性抗体选择性富集乙酰化肽段的方法[2]

4)         仪器

       质谱仪:Q ExactiveThermo Scientific,高性能四极杆的母离子选择性与高分辨的准确质量数(HR/AMOrbitrap检测技术相结合,分辨率高达140,000)。(2)

       纳升级高效液相色谱:Easy nLC1000Thermo Scientific)。(2)

       色谱柱:0.075MM*250MM (3μm RP-C18)

         Trap柱:0.1MM*20MM (5μm RP-C18 Thermo scientific EASY column)

Figure 2. Easy nLC1000 and Q Exactive

5)         数据分析

       数据由MaxQuant 1.2.2.5[3][4]分析,设置过滤参数详见表1,并计算Acetylated peptides score and Probabilities[3][4]

◆ 实验结果

1)         鉴定结果

          AB两组样品,实验共鉴定到1624个蛋白质,其中1026个是乙酰化蛋白质,共鉴定到2352个乙酰化肽段以及2227个乙酰化位点。图3为某乙酰化肽段的MS/MS图谱,表2为乙酰化肽段鉴定的部分结果展示。

Figure 3. The MS/MS spectrum of the acetylated peptide

 

Table 1. Parameters for data analysis



Table 2. Identification of the acetylated peptides

2)         乙酰化位点分析重复性

       取A组三次技术学重复实验对乙酰化位点重复性进行分析,三次实验中实验A1鉴定到1906个乙酰化肽段,实验A2鉴定到1902个乙酰化肽段,实验A3鉴定到1817个乙酰化肽段(图4)。82.53%的乙酰化肽段 (1687 of 2044) 出现在三次实验中,10.13%的乙酰化肽段 (207 of 2044) 现在两次实验中,7.33%的乙酰化肽段 (150 of 2044) 仅出现在一次实验中(图4)。结果表明三次实验间的相关性好,鉴定的乙酰化肽段数量稳定。

Figure 4. Venn Diagram of the three experiments

 

3)         重复相关性分析(Pearson Correlation

       由Basepeak图可见,三次技术学重复的Basepeak图具有较高的相似性(图5)。采用MaxQuant软件对两组样品乙酰化肽段的强度进行分析,计算三次实验之间的pearson相关系数,发现R值均大于0.9(图6, 7),说明三次实验重复性较好[5]


Figure 5. The mass spectra of basepeak in the six experiments

Figure 6. Pearson correlation of intensities of identified acetylated peptides in three experiments (A Group)

Figure 7. Pearson correlation of intensities of identified acetylated peptides in three experiments (B Group)

◆ 实验结论

(1)       A组三次技术学重复对乙酰化位点重复性进行分析,其中82.53%的乙酰化肽段(1687 of 2044)出现在三次实验中。

(2)       采用MaxQuant软件分别对两组样品乙酰化肽段的强度进行分析,计算三次实验之间的pearson相关系数,R值均大于0.9

(3)       总结:将乙酰化特异性抗体富集技术和高精度串联质谱技术相结合,可以进行大规模的蛋白质乙酰化位点的鉴定和定量分析,具有较好的重复性,在乙酰化蛋白质组学的研究中具有广阔的应用前景。

 ◆ REFERENCES

[1]       Guo A, Gu H, et al. Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation. Mol Cell Proteomics. 2014; 13(1): 372-87.

[2]       Tong Z, Kim MS, et al. Identification of Candidate Substrates for the Golgi Tul1 E3 Ligase Using Quantitative diGly Proteomic in Yeast. Mol Cell Proteomics. 2014; 13(11): 2871-82.

[3]       Olsen JV, Blagoev B, et al. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell. 2006; 127(3): 635-48.

[4]       Cox J, Mann M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 2008; 26(12): 1367-72.

         [5]        Lundby A, Secher A, et al. Quantitative maps of protein phosphorylation sites across 14 different rat organs and tissues. Nat Commun. 2012; 3: 876.



   
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