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蛋白质修饰位点定性分析

产品定义

蛋白质修饰位点定性分析——磷酸化、糖基化位点

蛋白质组学早期研究的绝大部分工作聚焦于细胞不同生长时期或是疾病、分裂素刺激下的蛋白质表达水平变化。然而,许多至关重要的生命进程不仅由蛋白质相对丰度控制,更重要的是被时空特异分布的、可逆的翻译后修饰所调控,因而揭示翻译后修饰发生规律是解析蛋白质复杂多样的生物功能的一个重要前提。

由于蛋白质发生修饰后其分子质量会发生相应的改变,同时质谱能够精确测定蛋白质或多肽分子质量,根据这一特性,开始将质谱应用于蛋白质翻译后修饰的鉴定。但由于翻译后修饰的蛋白质在样本中含量低且动态范围广,检测前首先需要对修饰蛋白质或肽段进行富集,然后才能进行质谱鉴定。


(1) —— 蛋白质磷酸化位点分析

磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一,与信号转导、细胞周期、生长发育以及癌症机理等诸多生物学问题密切相关。鉴定蛋白质磷酸化位点有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与生物学功能。目前,质谱是进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一。



(2) —— 蛋白质N-糖基化位点分析

蛋白质的N-糖基化位点修饰是最重要的蛋白质翻译后修饰之一,主要在复杂的多细胞或组织形成过程中起关键作用。蛋白质的N-糖基化修饰位点具有保守的氨基酸序列NX(S/T),其中X为除脯氨酸以外的其它氨基酸。


技术原理

——蛋白质磷酸化位点分析

蛋白样品中,发生磷酸化的蛋白质和肽段含量极低,且存在各种非磷酸化肽段和无机盐的干扰,致使检测磷酸化蛋白和磷肽段非常困难。因此,发展新型的富集方法和富集材料对磷酸化蛋白和肽段进行快速、准确地分析具有十分重要意义。

常用的磷酸化肽富集方法有固定金属离子亲和色谱法(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)、强阴阳离子交换色谱法、免疫法和金属氧化物富集法等。

在众多的金属氧化物中,TiO2是最常用、发展最成熟的一种。在酸性条件下,TiO2表面带正电,可以与磷酸化肽发生静电作用而达到吸附的目的。

样品经酶解后,用TiO2微球对磷酸化肽段进行富集,富集后的产物由高精度质谱分析,并通过专业软件完成数据检索。

——蛋白质N-糖基化位点分析

凝素亲和法是目前糖蛋白质组学中应用最广泛的分离富集方法。凝集素(lectin)是一类糖结合蛋白质,能专一识别某一特殊结构的单糖或聚糖中特定的糖基序列而与之结合,它们与糖链可逆非共价结合,糖蛋白或糖肽被凝集素捕获之后,通常用特定的单糖通过竞争结合凝集素将糖蛋白或糖肽洗脱下来。蛋白质经过酶解后利用凝集素(lectin)富集N-糖基化肽段,然后用N-糖酰胺酶(PNGase)在H218O中切除连接在天冬酰胺残基(Asn)上的糖链。该处理致使Asn分子量增加2.9890Da。最后用高精度LC-MS质谱仪检测脱糖后的肽段,并通过MASCOT软件检索数据库,确认脱糖后分子量与其理论分子量的变化以及糖基化修饰肽段的序列,从而确定该蛋白质的N-糖基化位点。

实验流程

                                        

            蛋白质磷酸化位点分析                                         蛋白质N-糖基化位点分析

使用仪器

Thermo Scientific Q Exactive

技术优势

● TiO2富集效率高达95%,可提高修饰肽段检测效率

● 基于高精度的质谱分析,对修饰位点精确鉴定

● 大规模的蛋白质组N-糖基化位点的鉴定与分析

应用领域

疾病机理研究        信号转导途径分析

样品要求

样品类型

样品要求

SDS-PAGE条带

5个以上可见考染条带

溶液(目标蛋白质)

目标蛋白质总量>50μg

目标蛋白质纯度>80%

溶液(大规模蛋白质组)

浓度>1μg/μl,蛋白总量>1mg

技术参考案例

[1]    Hutchinson EC, Denham EM, et al. Mapping the phosphoproteome of influenza A and B viruses by mass spectrometry. PLoS Pathog. 2012; 8(11).

[2]    Chumbalkar V, Latha K, et al. Analysis of phosphotyrosine signaling in glioblastoma identifies STAT5 as a novel downstream target of DeltaEGFR. J Proteome Res. 2011; 10(3): 1343-52.

[3]    Wang S, Wang J, et al. PKC-mediated USP phosphorylation at Ser35 modulates 20-hydroxyecdysone signaling in Drosophila. J Proteome Res. 2012; 11(12): 6187-96.


   
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