干货分享 | 人胰岛素及其类似物的分析方法综述（二）

方法原理

TRFIA 是基于时间分辨荧光技术的免疫分析方法。胰岛素与细胞受体结合后，引发受体 β 亚基酪氨酸磷酸化，磷酸化基团与抗受体 α 抗体和铕标记抗体以双抗夹心的方式形成复合物，通过酸性增强液的加入将固相抗体复合物解离，随后与增强液中的二酮、辛基膦分子形成螯合物，从而形成高度且均匀的荧光。通过检测荧光信号可以定量测定胰岛素的生物学活性。

应用实例

杨艳枫等人利用时间分辨荧光免疫分析系统建立人胰岛素基于转基因细胞的生物学活性检测方法。以 CHO - INSRB1284 转基因细胞（2.5×10⁵个・mL⁻¹）作为靶细胞，以 400 pmol・mL⁻¹ 作为初始浓度对人胰岛素进行 3 倍系列稀释，随后药物与靶细胞作用 20 min，通过时间分辨荧光免疫分析系统，进行生物学活性检测。

该方法人胰岛素存在良好的量效关系，符合四参数方程。该方法专属性强，相对准确度、精密度良好，线性范围为 64% - 156%，斜率为 1.031，R² 大于 0.98。

除了 TRFIA 方法外，还有一些其他的生物学活性分析方法，如葡萄糖氧化酶 - 过氧化酶法、基于细胞信号通路的体外生物学活性测定方法等。

葡萄糖氧化酶 - 过氧化酶法是通过测定小鼠血糖的降低来评价胰岛素效价，但该方法存在实验操作繁杂，精密度差等缺陷。基于细胞信号通路的体外生物学活性测定方法由于其操作简便，特异性好，灵敏度高等优点逐渐得到广泛应用。

专属性是指分析方法能够准确地测定目标物质，而不受其他物质的干扰。在人胰岛素及其类似物的分析中，专属性是非常重要的。

例如，在甘精胰岛素注射液有关物质分析中，通过空白溶液进样、破坏性试验等方法考察了方法的专属性。结果表明溶剂不会干扰甘精胰岛素注射液有关物质的测定，在高温、强酸、强碱、强光照和强氧化等破坏作用下产生的降解产物均能与主峰有效地分离开，具有良好的分离度，表明该方法具有良好的专属性。

线性是指分析方法在一定范围内，测定结果与样品浓度之间呈线性关系。范围是指分析方法能够准确测定的样品浓度范围。

在人胰岛素及其类似物的分析中，通常通过制备一系列不同浓度的标准溶液，然后进行测定，绘制标准曲线来考察线性和范围。例如，在甘精胰岛素注射液有关物质分析中，将系统适用性溶液按 2 倍比例逐级稀释至 0.11 mg・mL⁻¹，制成线性范围研究的系列溶液，分别以测得的甘精胰岛素主峰和有关物质 3B - 琥珀酰亚胺 - 甘精胰岛素峰的峰面积响应值为纵坐标，以甘精胰岛素浓度和有关物质 3B - 琥珀酰亚胺 - 甘精胰岛素的浓度作为横坐标，分别做标准曲线，其结果符合线性相关。

精密度是指分析方法在相同条件下多次测定同一样品时，测定结果的一致性程度。精密度通常用相对标准偏差（RSD）来表示。

在人胰岛素及其类似物的分析中，通过重复进样、平行制备样品溶液等方法考察精密度。例如，在甘精胰岛素注射液有关物质分析中，将样品溶液重复进样 6 针，记录甘精胰岛素主峰保留时间以及峰面积响应值，计算其 RSD。结果 6 针重复进样保留时间的 RSD 为 0.12%，主峰峰面积响应值的 RSD 为 0.026%，精密度良好。

重复性是指在不同时间、不同操作人员、不同仪器等条件下，使用同一分析方法对同一样品进行测定时，测定结果的一致性程度。

在人胰岛素及其类似物的分析中，通过平行制备多个样品溶液，然后进行测定，计算 RSD 来考察重复性。例如，在甘精胰岛素注射液有关物质分析中，平行制备样品溶液 6 份，分别测定其总有关物质的百分含量。结果 6 份样品溶液总有关物质含量分别为 0.613%、0.615%、0.620%、0.610%、0.632%、0.611%，RSD 为 1.3%，表明该方法具有良好的重复性。

稳定性是指样品在一定条件下，在一定时间内保持其性质不变的能力。在人胰岛素及其类似物的分析中，需要考察样品溶液的稳定性。

例如，在甘精胰岛素注射液有关物质分析中，将样品溶液分别于 0、2、4、6、8、12、24 h 分别进样，记录色谱图，主峰纯度分别为 99.837%、99.839%、99.839%、99.844%、99.839%、99.842% 和 99.844%，表明样品溶液在 24 h 内比较稳定。

定量限是指分析方法能够准确测定的最低样品浓度，检测限是指分析方法能够检测到的最低样品浓度。

在人胰岛素及其类似物的分析中，通过稀释样品溶液，然后进行测定，计算信噪比来确定定量限和检测限。例如，在甘精胰岛素注射液有关物质分析中，取样品溶液适量，加入 0.01 mol・L⁻¹ 盐酸溶液分别稀释制备质量浓度为 0.11μg・mL⁻¹ 的甘精胰岛素溶液作为定量限溶液，质量浓度为 0.036μg・mL⁻¹ 的甘精胰岛素溶液作为检测限溶液，分别进样，记录色谱图，其信噪比分别约为 12.91 和 3.47，因此推算定量限和检测限分别约为 2.20 ng 和 0.72 ng。

人胰岛素及其类似物的分析方法包括结构分析、有关物质分析和生物学活性分析等方面。液质联用技术、反相高效液相色谱法、时间分辨荧光免疫分析法等是常用的分析方法。在进行分析方法的建立和验证时，需要考虑专属性、线性和范围、精密度、重复性、稳定性、定量限和检测限等因素。通过对人胰岛素及其类似物的全面分析，可以确保这些药物的质量和安全性，为糖尿病的治疗提供有力的保障。随着生物技术和分析技术的不断发展，未来可能会出现更加先进和准确的分析方法，为人胰岛素及其类似物的研究和应用提供更好的支持。