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Immunity | 单细胞空间多组学绘制人类扁桃体细胞图谱

2024-03-27

中科新生命

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腭扁桃体是次级淋巴器官（SLOs），是抵抗吸入或摄入病原体的第一道免疫防线。2024年2月13日，来自西班牙巴塞罗那的研究团队在Immunity（IF=32.4）上发表“An atlas of cells in the human tonsil.”的研究，通过单细胞转录组、表观基因组、蛋白质组、免疫组库及空间转录组技术绘制了扁桃体的细胞图谱，确定121种细胞类型和细胞状态，定义了扁桃体的发育轨迹，帮助人们理解扁桃体的功能单位。

研究步骤

步骤一：综合单细胞空间多组学绘制跨年龄人类扁桃体单细胞图谱；

步骤二：分析早期CD4+T细胞发育轨迹及亚群细分；

步骤三：鉴定组织驻留CD8+T细胞状态及细胞类型；

步骤四：B细胞LZ-DZ转化过程中的瞬时表观遗传重编程；

步骤五：SIX5 TF于PC的特殊活动；

步骤六：描绘人类扁桃体的非淋巴组织驻留和髓细胞异质性及公开分析内容。

研究结果

1. 人类扁桃体细胞的单细胞多组图谱

本研究设置幼年(n=6,3-5岁)，青年(n=8,19-35岁)和老年(n =3,56-65岁)共计17例样本进行scRNA-seq，与此同时使用scATAC-seq 、CITE-seq、scBCR/TCR-seq及空间转录组(ST)辅助分析，多种组学联合共分析得到9个大群和23个亚群，生成了人类扁桃体细胞图谱。

图1 人类扁桃体细胞的单细胞多组图谱

2. 人类扁桃体早期CD4+ T细胞命运的决定

T滤泡辅助细胞(Tfh)的分化始于DC向幼稚 CD4 T细胞呈递抗原，随后激活并分化为中枢记忆(CM) CD4 T细胞。本研究鉴定两个CM T细胞亚群，一个CM CD4 T细胞群表达了更高水平的滤泡基因(如IL6ST)，表明Tfh分化的早期信号。根据BCL6和PRDM1的活性，将剩余的CD4 T细胞分为Tfh细胞和非Tfh细胞，仅在Tfh细胞中观察到克隆扩增。分析最终确定扁桃体中CD4 T Treg的三种亚型：（1）Effector Tregs (Eff-Tregs)表达典型Treg Marker，转录因子(TF)PRDM1、RORC、MAF家族和IKZF3的活性增加；（2）Eff-Treg高表达IL-32 (Eff-Tregs-IL-32)，IL-32是一种先前认为与抑制抗肿瘤反应有关促炎分子；（3）T滤泡调节细胞(Tfrs)，下调FOXP3, IL-2RA (CD25)和PRDM1，Tfr细胞进一步表现出幼稚标志物增加，这与LEF1和TCF7的TF活性增加一致。

图2 人类扁桃体中CD4 T滤泡细胞和非滤泡细胞的命运决定

3. 扁桃体隐窝上皮下结缔组织中隔内的组织驻留CD8+ T细胞

幼稚CD8+ T亚群在遇到抗原后启动效应分化程序并随后形成记忆状态。近期形成的记忆群体显示干细胞记忆T细胞(SCM CD8 T)自我更新并产生长寿的CM T细胞(CM CD8 T)的分化层次，CX3CR1标志着CM CD8 T向效应记忆T细胞(EM CD8 T)分化，且受到TBX21 (TBET)的严格控制。总之，鉴定了两组驻留记忆(RM) CD8 T细胞、CD8 Tf细胞、MAIT、CD161+Vδ2+γδ T细胞、非Vδ2+γδ T细胞以及非常规ZNF683+CD8 T细胞和TIM3+DN（CD8-CD4-）T细胞。

图3 人扁桃体中CD8和ILCs的表达

4. B细胞LZ-DZ转化过程中的瞬时表观遗传重编程

为描绘NBC到GCBC的转变，整合了非增殖暗区GCBC (DZ-GCBCs)。本研究鉴定到休眠的NBC，早期激活的NBC及一个增殖且无任何GC标记NBC亚群。在GCBC细胞内，由细胞周期调控的DZ和光区(LZ)的基因表达差异驱动转录组多变。随后研究DZ和LZ循环动力学，发现DZ细胞在产生LZ-GCBCs之前，逐渐降低细胞周期基因的表达，并通过中间的DZ-LZ表型转移。从表观遗传学上表征DZ到LZ和LZ到DZ的转变，发现DZ到LZ的过渡是无缝的，大多数DZ和LZ特有的可达性差异区域显示为中间水平，但LZ到DZ的转变中广泛存在表观遗传重编程。

图4 B细胞活化和GC动力学

5. SIX5 TF于PC的特殊活动

随后分析来自不同滤泡组织切片在整个空间轨迹的基因表达变化，显示PC包含不同的IgM/D和IgG/A区域。再整合scRNA-seq和scATAC数据，两两差异可及性分析显示，在PCs和PC前体之间以及从MBCs到成熟PC差异最大，意味着细胞命运转变涉及广泛的染色质编程。聚类所有差异可及区(DARs)确定了与PC、GCBC和B细胞亚群相关的染色质动力学的三个主要模块，发现TF基序的代表性过高与其关系为（1）PC模块IRF家族(IRF8和IRF4)和的MESP1;（2）GCBC模块中的EBF1、PAX5、NFKB1、RELA/RELB、MEF2C;（3）B细胞模块中的EBF1、PAX5、SPIB、SPI1和ETV3/ETV6。

本研究发现一种尚未在PC中描述的TF-SIX5，可能与PC成熟的后期有关。SIX5的PC特异性表达在bulk RNA-seq、ChIP-seq、scRNA-seq数据中得到证实。同样，SIX5的预测靶基因(PDK1、TMEM198、ITM2C、BHLHA15/MIST1、SLC38A2和TSC22D3/GILZ)在成熟PC中可及性和选择性表达增加。体外实验验证揭示SIX5在多发性骨髓瘤(MM，一种PC衍生肿瘤)中基因和蛋白水平的表达上调，表明SIX5是成熟PCs的一个新标志物，在MM肿瘤发生的调节中具有潜在的作用。

图5 人扁桃体浆细胞分化和细胞身份调节

6. 人类扁桃体的非淋巴组织驻留和髓细胞异质性

随后作者分析了扁桃体中的非淋巴组织驻留和骨髓细胞异质性，鉴定了单核细胞、M1巨噬细胞、肥大细胞和中性粒细胞，此外，作者发现并验证先前从未表征的四种slan样细胞亚群，它们具有不同的空间位置，可以控制免疫反应的不同方面，这些 slan 样细胞包括以下细胞：（1）表达金属蛋白酶和Toll样受体的MMP 细胞;（2）表达补体成员和 II 类 MHC 基因的 C1Q 细胞;（3）表达载脂蛋白和岩藻糖苷酶的 SELENOP 细胞;（4）TGAX 细胞表达清道夫受体，并通过FACs和scRNA-seq进一步验证了slan+细胞注释。

图6 人扁桃体骨髓细胞的异质性

7. 扁桃体是一种HCA资源

作者开发HCATonsilData来公开本研究数据，提供了详细的术语表，列出该研究121种细胞类型和状态的注释证据。作者在扁桃体图谱的背景下分析两个MCL数据，其细胞状态似乎与正常B细胞状态相似，在从活化的NBCs到GC-committed细胞的成熟间隔中检测到标记物，还观察到两个金属硫蛋白基因表达增加的cluster，这种细胞状态最近被认为是癌症复发性肿瘤程序。总之，这些分析表明MCL细胞并没有冻结在特定的成熟阶段，但它们保留正常B细胞的一定分化潜力。因此，扁桃体图谱可以提供肿瘤细胞状态正常对应体的信息，并可能查明其他疾病驱动机制。

图7 扁桃体图谱的传播与应用

总结

本研究通过单细胞空间多组学，提供了人类扁桃体细胞的详细分类，共鉴定121种细胞类型和状态，并以空前的分辨率描述了与NBC向GC激活相关的逐步成熟阶段，DZ和LZ之间的GC动态及PC分化的多种状态。此外，作者还设计HCATonsilData公开研究数据。综上所述，作者描绘的人类扁桃体图谱代表了对扁桃体细胞类型和状态的全面普查，可用于绘制器官复杂性图谱和注释正常和患病细胞蓝图。