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【代谢专栏】植脂高峰|脂质组揭示拟南芥热应激的响应机制

2018-08-15
中科新生命
3693

哈佛大学公共卫生学院近期在《Plos Medicine》上发表了一篇关于气温和认知关系的文章研究发现居住在无空调、温度更高的住所的年轻人,认知功能明显受到影响,反应速度下降13%,对事件的处理能力也降低了10%左右!最近上海连续多天高温30多度,难怪小编觉得自己都热傻了。


同样的植物也会面临高温的压力,那么高温到底会对植物有什么影响呢,而植物到底又是如何响应这种热应激的呢?所以今天小编要解读的是上个月发表在《Plant Cell》一篇关于植物热应激响应机制的文章。


往期的专栏内容可以点击文末“阅读原文”进行查看,或打开链接:http://dwz.cn/MxxVuPaT


HEAT INDUCIBLE LIPASE1 Remodels Chloroplastic Monogalactosyldiacylglycerol by Liberating α-linolenic acid in Arabidopsis Leaves under Heat Stress

Plant Cell IF=8.228


研究材料

拟南芥叶片


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研究路线


陆生植物通常会因为气候变化而遭受高温胁迫。热应激会增加细胞膜的流动性,所以植物进化出了一套通过改变细胞膜的脂质组成增加其稳定性的调节机制,从而有效抵御热应激。

在之前的研究中,作者通过脂质组学发现热应激引起叶绿体中含有多不饱和酰基的MGDG等甘油脂含量下降,含有18:3脂肪酸酰基链的PC、DAG和TAG含量的升高。同时转录组学的数据也表明热应激诱导的基因参与TAG合成、分解和脂肪酸的β-氧化等脂代谢过程。所以,作者假设还有一些未鉴定的基因,它们编码位于叶绿体受热应激诱导的脂肪酶。在热应激下它们参与叶绿体甘油糖脂的分解代谢释放18:3,促进含18:3TAG的合成。


研究结果

1.  热应激诱导HILI表达

据报道拟南芥约有300个推定的脂肪酶(酰基水解酶)基因。 作者之前的研究已经通过基因芯片技术对181个推定的基因的表达水平进行了定量分析。层次聚类分析将这181个基因聚类成了12个group,如图1A所示。group 9和10的24个基因受热应激诱导,在温度恢复期间,恢复正常表达水平。利用SUBA数据库对这24个基因定位,其中LPPε1和HIL1定位于叶绿体。LPPε1被报道是叶绿体磷酸酶的基因。HIL1目前没有详细的报道,除了被拟南芥信息资源数据库(TAIR)注释为一种推定的TAG脂肪酶基因芯片数据结果表明与对照组相比HIL1在热应激后的8小时和24小时表达量分别增加了2.1和2倍,在温度恢复过程中表达量又逐渐回到对照组的水平,如图1B所示。HIL1的逆转录定量RT-qPCR实验验证了基因芯片的结果,如图1C所示。这些结果暗示HIL1在叶绿体对热应激的适应过程中起着重要作用


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图1


2.  HIL1定位叶绿体

作者对HIL1的编码序列进行了研究。HIL1编码854种氨基酸残基组成的多肽序列HIL1是一个包含脂肪酶样结构域、C2结构域和cTP序列(叶绿体转运肽的结构,如图2A所示。蛋白质组数据库和其序列结构中的cTP序列暗示HIL1定位于叶绿体,荧光定位实验更是进一步证实


3.  HIL1 同源基因在植物物种中进化保守

在TAIR数据库没有找到任何HIL1基因的同源序列HIL1基因的脂肪酶样结构域与DAD1样蛋白的脂肪酶结构域比较相似。系统进化树分析结果如图2B所示。HIL1位于12种DAD1样蛋白的远端。对比DAD1样蛋白序列,HIL1在N端有一个C2结构域和一段未知的中间区域。另外,HIL1脂肪酶样结构域有6个内含子,而DAD1样蛋白没有或者只有一个。因此序列分析的结果揭示HIL1编码的是一种特殊的脂酰水解酶,与DAD1样蛋白不同。

为了进一步调查进化关系,HIL1的整个氨基酸序列与Uniprot数据库进行了Blast分析结果表明同源基因广泛分布于十字花科,豆科植物,真双子叶植物,单子叶植物,无油樟科,石松门和苔藓,如图2C所示。这些进化研究表明,HIL1样蛋白在陆生植物中可能具有广泛的不可或缺的功能


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图2


4.  HIL1生理功能研究

为了研究HIL1在拟南芥中的生理功能,将命名为hil1的T-DNA 插入突变株用于反向遗传分析另外作者还在hil1突变株中引入了HIL1的基因组序列,构建了hil1/HIL1互补型植株,如图3A所示。


作者对17日龄的野生型、hil1突变株和hil1 / HIL1互补型植株的叶片HIL1转录本进行了RT-PCR和RT-qPCR分析,结果如图4B和4C所示。hil1突变株N端和中间区域没有转录,但是C端仍然表达,尽管在22℃它表达的水平低于野生型植物。hil1/HIL1#3和#6植株的HIL1表达水平高于野生型(在22℃下为6.9倍和10.4倍)。hil1/HIL1#9植株的HIL1表达水平跟野生型差不多。在热应激下,HIL1的表达都增加了。这些结果表明HIL1表达水平HIL1基因组DNA的插入位置而变化,并且野生型、hil1突变株和hil1 / HIL1株的HIL1都受热应激诱导。

hil1突变株在正常的条件下并没有表现出肉眼可见的变化。作者进行了植物的耐热性测试,如图3D所示。植物首先在38℃下预处理2小时,然后在45℃下进行165或180分钟,之后放置在22℃下7天。野生型和hil1/HIL1互补型植株都耐受热冲击,而hil1突变体的叶子严重漂白。热应激后hil1突变体的存活率与野生型和hil1 / HIL1互补型植株相比,显著降低(P <0.001,Welch's t检验)。同时作者观测到植株的光合活性随着热应激时间的增加而下降,hil1与野生型和hil1/HIL1互补型植株并没有显著差异。这些结果表明hil1突变体中HIL1的损伤导致其暴露于热冲击后恢复过程中存在重大的生长缺陷,但不影响短期热应激下的光合活性。

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图3


5.  HIL1影响甘油糖酯代谢

为了确定HIL1对甘油糖酯代谢的贡献作者采用脂质组学技术对野生型,hil1突变体和互补型的hil1 / HIL1叶片的甘油糖酯组成进行比较,结果如图5所示。在拟南芥叶片中一共检测到96种脂质分子,其中62种在所有的样本种都检测到了。34:6-MGDG和34:6-DGDG的变化趋势相似,36:6-PC,36:6-PE和54:9-TAG变化趋势也比较相似,如图4所示。热应激下含18:3的脂质分子的重塑发生在34:6-MGDG、34:6-DGDG、36:6-PC,36:6-PE和54:9-TAG之间,这个过程部分由HIL1的功能介导。

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图4


6.  HIL1重组蛋白具有脂肪酶的活性,偏好释放18:3脂肪酸

作者构建了一个大肠杆菌表达系统,然后纯化获得了HIL重组蛋白(MBP-mHIL1),如图5A所示。MBP-mHIL1蛋白与拟南芥叶片一起体外共培养,MGDG, DGDG, SQDG, PG, PC, PE和DAG亚类下的几种脂质分子含量显著下降。34:6-MGDG 和36:6-MGDG是MGDG亚类下面含量最丰富的两种脂质,很有可能是HIL重组蛋白真正的底物,如图5B所示。所以作者又将HIL重组蛋白与购买的34:6-MGDG 和36:6-MGDG混合物一起培养,结果18:3游离脂肪酸含量增加,如图5C所示。因此这些结果表明含有多不饱和酰基的MGDG脂质是HIL理想的作用底物。HIL重组蛋白偏好剪切甘油的sn-1位,释放18:3游离脂肪酸。


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图5


7.  HIL1的基因共表达网络分析

为了了解是否存在与HIL1功能上相关的其他候选基因,作者进行了基因共表达网络分析,结果显示HIL1与CLPB3和DGD1密切相关,如图6A所示,暗示HIL1和其共表达的基因在叶绿体热应激下发挥着重要的协同保护功能。在大豆、西红柿、苜蓿、大米和玉米中,同样也存在HIL1的同系物与CLPB3和DGD1的同系物共表达,如图6B所示,暗示HIL1、CLPB3和DGD1同系物之间的共表达关系在植物物种之间是保守的。最后作者通过共表达网络也进一步发现了许多参与甘油脂代谢的热应激响应基因,如图6C所示。

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图6


结论:热应激诱导HIL脂肪酶的表达,从而影响叶绿体基因中的甘油脂代谢,尤其是含有多不饱和酰基的MGDG脂质分子。HIL释放出的18:3游离脂肪酸被转换成质网细胞膜的组成,增加膜的稳定性,从而提高植物的耐受力。

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小编心得

1.   研究思路

细胞膜组成的改变肯定会涉及脂代谢酶的参与,所以这篇文章的研究思路是先从基因层面上寻找脂肪酶的表达差异,然后挑选了HIL基因进行深入研究,并通过脂质组学的分析,进一步发现HIL的作用机制。


2.   脂质组学

脂质作为生物体膜结构的主要成分,也是一种能量物质和信号分子。无论是植物的成长发育和应激胁迫都会涉及到脂质的变化中科新生命的脂质组学技术平台采用的是高端大气上档次的Orbitrap平台, 结合lipidsearch能够为客户提供上述的8大类脂质species水平的定性定量结果,有着严格的QC控制和丰富的数据分析内容。欢迎来电咨询。