【文献解读】[iTRAQ]—rps基因敲除

Rps14 haploinsufficiency causes a block in erythroid differentiation mediated by S100A8/S100A9

S100A8/S100A9参与调控Rps14 单倍剂量不足可致红系分化障碍

研究背景：骨髓增生异常综合征亚型（MDS-5q）常与核糖体蛋白小亚基14（Rps14）相关。RPS14杂合基因缺失会导致骨髓增生异常综合征亚型（MDS-5q），且与该疾病红细胞生成受损的特征相关。核糖体蛋白（ribosomal protein, RP）基因突变引起蛋白单倍剂量不足可介导RP-MDM2-P53环路，导致P53积聚，进而导致红系分化障碍。因此，PR蛋白异常往往和血液系统疾病息息相关，但其作用机理尚不明了。S100A8蛋白（钙粒蛋白A）蛋白)与S100A9（钙粒蛋白B）均属于钙结合蛋白S100蛋白家族成员,两者常以钙离子依赖性方式形成异源二聚体S100A8/A9蛋白复合物。作为重要的促炎介质，参与多种疾病的病例进程。该研究旨在探索血液学表型与Rps14单倍剂量不足之间的分子调控机制。

样本来源：Rps14 KO小鼠Vs野生型小鼠红系祖细胞

技术方法： iTRAQ+WB验证+目标蛋白功能验证

研究结果：

Rps14单倍剂量诱导红系分化缺陷

敲除小鼠Rps14基因造模，诱导Rps14单倍剂量不足，引发贫血。550天后小鼠网状红血球急剧下降，并造成部分小鼠死亡。且使得造血干细胞和祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPC）无法正常分化，核糖体蛋白合成受到影响。

Fig1. 野生小鼠与Rps14模型鼠血红蛋白含量、网状红血球数目及存活天数

蛋白质组学相对定量共鉴定到3524个蛋白，26个差异蛋白（unique peptides≥2，ratio≥2）。

在单倍剂量不足的造血干细胞中，核糖体相关蛋白表达下调，与先天免疫信号相关的蛋白，尤其是异二聚体S100a8/S100a9的表达显著升高。

Fig2. 不同细胞系蛋白表达火山图

Rps14单倍剂量不足的小鼠中普遍观察到快速发展的贫血症状

这些小鼠的骨髓细胞中S100a8的表达量均显著升高，S100a8的表达影响了造血功能。

Fig3. S100a8免疫组化染色及q-PCR定量

Rps14单倍剂量不足的细胞中p53可诱导S100a8的表达

红系造血岛是哺乳动物红血球合成的功能单位，由一个中央巨噬细胞延伸的胞质突起至周围的红血球环状结构。在本实验中，巨噬细胞和红血球细胞中S100a8的表达量均显著升高，因此随之检测了红系造血岛中S100a8和P53的表达量。在Rps14单倍剂量不足的骨髓细胞中个，接近巨噬细胞处检测到S100a8的高表达，其中一部分检测到P53的表达。为了证实p53的表达是受S100a8的诱导，采用流式细胞仪检测二者的共表达情况。在有、无p53以及p53稳定存在的三种情况下，检测了S100a8的表达情况。结果表明，Rps14单倍剂量不足的细胞中p53可诱导S100a8的表达。在Rps14单倍剂量不足细胞中还检测了S100a8 mRNA的表达情况，检测结果显示Rps14的低表达和S100a8的高表达。另外还检测到Tnfa基因的表达升高，而Tnfa是异二聚体S100a8/S100a9的下游靶点，可强有力抑制红血球生成。红细胞转录因子K1f1和Gata1表达下调，这与红系分化受损的表型相吻合。

Fig4. 激光共聚焦检测S100a8及p53的表达

S100A8通过刺激巨噬细胞和单核细胞来促使炎症环境形成

为研究Rps14单倍剂量不足是否能引发炎症环境，进而抑制红细胞合成，检测了血清中40种细胞因子的水平。结果显示MIP/CCL3, CXCL9, RANTES, 和IL12(p40)四种细胞因子在Rps14单倍剂量不足的细胞中表达水平升高。最近的研究表明，S100A8和S100A9是Tlr4的活化因子，本实验的研究结果显示，Tlr4的表达在巨噬细胞和单核细胞中被激活，但在成红细胞中并未被激活。这表明S100A8是通过刺激巨噬细胞和单核细胞来促成炎症环境的。

Fig5. 细胞因子表达量检测

S100a8/Tlr4对于红系分化起到至关重要的作用

重组S100a8在野生型细胞中显著诱导红细胞分化缺陷。通过对S100a8基因钝化，Rps14造血干细胞红系分化缺陷得以修复，p53表达降低。这表明S100a8/Tlr4对于红系分化起到至关重要的作用。Tnfa敲低对红细胞生成的影响效果低于上述两种处理，对S100a8的表达则没有影响，表明其在促炎效应中处于S100a8的下游。

Fig6. 基因干预对Ter119和S100a8表达的影响

小编心得：这是一篇通过iTRAQ技术手段筛选骨髓增生异常综合征亚型（MDS-5q）关键调控蛋白，并采用各种验证手段对关键蛋白S100a8进行表达验证、功能验证及上下游调控验证，发表在Nature Medicine上的一篇病理机制的经典文献。该实验结果使得Rps14单倍型缺失与S100a8调节的天然免疫系统激活和MDS-5q 的p53依赖型红系分化缺陷产生了关联，为MDS病理机制研究起到了巨大的推动作用。

文献来源：Rps14 haploinsufficiency causes a block in erythroid differentiation mediated by S100A8/S100A9

【https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26878232】