【客户文献】想找大神怕被坑？Label free带你飞~

植物与病原菌的相互作用，可以看成一部植物免疫系统抗击外来侵略者的血泪史。在病原菌侵染植物的过程中，细胞核是免疫系统与外来病原斗争的主战场。来自英国邓迪大学的研究团队提出了一个大胆的想法：通过比较不同战况的细胞核蛋白组变化，就能够揭示这场战争中的大神到底是谁~

Quantitative analysis of the tomato nuclear proteome during Phytophthora capsici infection unveils regulators of immunity

【https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28394025】

IF=7.33

为了验证这个想法，研究团队选中了辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）和番茄（番茄：什么仇什么怨啊？！）作为研究对象，并利用Label free分级技术观察了疫霉菌侵染过程中番茄细胞核蛋白组的变化。（Howden A J, et al.,New Phytologist, 2017.）本次实验共设计了4组样品，分别为：8 h对照组（8-h NI）、24 h对照组（24-h NI）、8 h侵染组（8-h I）以及24 h侵染组（24-h I）。                                             

那么，到底谁是大神呢？我们一起来看看结果。

1.    不同侵染时间下番茄核蛋白组的差异表达

研究团队在进行蛋白提取前，先对细胞核进行了富集，并且通过Western Blotting验证了细胞核富集成功。在蛋白组分析过程中，该团队使用了Label free技术，每个样品分为8级，分析软件为MaxQuant，分别搜了番茄和辣椒疫霉菌的数据库。最终，本次共鉴定到3975个蛋白。在去掉污染蛋白和疫霉菌蛋白以后，研究团队分别使用PredictNLS、NLStradamus、NoD和wolf psort对剩余的番茄蛋白进行了亚细胞定位分析，有2548个番茄蛋白得到了预测分析结果。

在蛋白组定量分析中，研究团队使用Perseus进行了四组比较，分别是 8-h I vs 8-h NI、24-h I vs 24-h NI、24-h I vs 8-h I以及24-h NI vs 8-h NI，得到了蛋白的倍数差异和有无差异结果。结果显示，在侵染早期，番茄核蛋白组的变化相对较小，研究重点被放在了24-h I vs 24-h NI这一组上。

2.    分析功能，缩小范围

24-h I与24-h NI 的比较结果显示，共有507个蛋白的丰度增加，173个蛋白的丰度降低。GO分析结果显示，部分细胞核及其进程相关蛋白以及过氧化物酶等非核蛋白可能在疫霉菌侵染过程中被改变。以下这张图堪称全文亮点，给了大（bian）家（shen）一个形象的展示，获得好感+1~

3.    锁定目标，重点验证

结合前人研究成果，团队将目标锁定至AHL（AT-HOOK-LIKE）蛋白家族，并在本次实验鉴定到的差异蛋白中的挑选了5个（AHL1、AHL5、AHL9、AHL17a 和 AHL17b）作为进一步研究的对象。通过在克隆编码基因并在烟草中过表达目标蛋白，结合激光共聚焦、Western Blotting以及病原菌侵染实验，共同验证了AHL作为调控因子，在针对辣椒疫霉菌侵染的免疫过程中发挥作用，过表达AHL1、AHL5以及AHL9可以增强对辣椒疫霉菌的抗性。大神现身！！

通过这个案例，我们总结一下：

1.    定量蛋白组学可谓是大海捞针的制胜法宝，当你找不到目标时，它总会为你照亮前进的方向；

2.    Label free加分级，能够获得更大的数据量，华丽升级后轻轻松松带你飞；

3.    比较蛋白组找差异，功能分析锁定目标，基因、蛋白、表型水平验证，是植物蛋白组学研究的王道。想要验证更轻松？没问题！下次，让我们聊聊PRM~