上期【知道】，跟各位老师分享了非靶向蛋白质组学技术的热门新技术—DIA：【知道】蛋白质组研究想用DIA？您需先了解的两大问题。本期，我们将视线从上游转移到下游，跟大家聊聊靶向定量蛋白质技术——PRM（Parallel Reaction Monitoring）
为什么特别关注靶向蛋白技术？
因为目前蛋白质组发表文章的要求，已形成了明确的趋势，即“做完组学不验证，reviewer不发通行证”。而靶向蛋白检测技术如PRM，是目前组学结果验证技术中，应用关注度最高的。
虽然发文章不是本期的核心主题，但是小编认为，我们有必要先聊聊蛋白组结果验证的那些事。作为15年蛋白组老司机，上百篇项目文章的经验明确告诉我们：早些年，蛋白质组的结果验证是文章高配；这些年，蛋白质组结果验证已逐渐变为标配。甚至我们还遇到过：杂志主动约稿的稿件被审稿人退回，要求用靶向技术对定量结果进行验证。在我们苦口婆心建议各位老师做验证的背后，是一个个悲惨的故事。不少研究者抱有侥幸心理：先投稿，如果审稿人要求验证，再回头补。而现实结果往往是：稿件中对某些“重要的”差异表达蛋白进行了“充分”的阐述和意义描述，但最后在revision补实验的结果中，该蛋白并没有差异表达，这就是传说中的釜底抽薪feel没错了。
所以，蛋白质组的结果验证要做在前面，事后再补的风险很大。可能，很多老师有自己的委屈：研究的物种、蛋白没有好的抗体，没法做WB；而PCR只能验证mRNA水平，转录水平有时与蛋白水平并不一致。诚然，放在以前，这是好用的回复套路。但现在用这些理由说服reviewer，已经行不通了，因为基于质谱的靶向检测技术，几乎解决了这个问题。
这是一篇前几年发表于《Molecular &Cellular Proteomics》（下文简称MCP）的Editorial，作者是《MCP》的正、副主编。这几年，我们看到的很多审稿意见中，不少审稿人对验证实验要求的描述，直接就是说：“one suggestion is that PRM or MRM based targeted proteomic strategyshould be used for validation”“validate the expressionlevels of XX proteins discussed in the manuscript by using MRM/PRM assays”。两者之间的联系和含义，相信无需笔者多说。
关于验证必要性的问题，我们先谈到这里。回到本期主题，如何利用靶向质谱技术—PRM来轻松愉快地进行蛋白组学的验证呢？PRM技术是近几年靶向质谱技术的热门，从蛋白质组结果验证到非组学目标的靶向检测，从基础研究再到临床治疗与诊断，都被广泛接受和应用。大有超越经典技术SRM/MRM之势（PRM技术优势见上述推荐文章）。
PRM技术应用的高歌猛进毫无悬念，而作为国内早期开展PRM技术、PRM文章发表较多的平台，我们更关注的却是PRM火爆应用背后的隐忧：
作为靶向技术，尤其是作为验证技术，有什么技术要求或标准？
您看PRM的数据结果时，是否只看Excel表格中样本表达量的数值？
也许不少自己做实验的老师，对上述问题也未必有明确认识；另一方面，检测服务市场上的不同服务平台，PRM的做法也千差万别。要明确上述问题其实不难，业界权威已给出解答：蛋白质组专业领域top1期刊《MCP》对于靶向蛋白组方法有明确的guideline（https://www.mcponline.org/content/guidelines-publication-manuscripts-describing-development-and-application-targeted-mass），可以看做是领域标准或共识。
该guideline较长，我们截取比较关键的部分做两点讨论。
01 靶向检测方法，需要具备的特征和要求
图中标记处，指出：区别于发现阶段的非靶向组学，靶向分析技术需要具备两个最基本的特征：“measure repeatedly”和“internal standards”：
1. “measure repeatedly”：如果一个靶向检测方法，缺乏稳定性、重现性，有何资格作为验证技术？所以，如果某些平台在建立PRM方法时，仅仅认为是确立好离子对条件就行了，只是看下所的监测肽段是否能被扫描到，这不能算建立了一个合格的PRM分析方法。对所建PRM方法进行重现性、稳定性的考察是非常必要的。以我们平台为例，在确立好PRM的检测条件和方法后，我们通常会再进行多次上机，对多次检测所得的定量值进行RSD值计算，来考察所建立的方法是否具有良好的重现性，才能保证所建立方法的可靠性，如下图所示：
2. “internal standards”：为了减少实验误差，需要在样本中掺入内标，以便校正实验误差，保证结果准确性。如果PRM方法不够准确，自然也不能达到合格验证方法的要求。也就是说，一般需要预先在每个样本中掺入等量的内标品（最好是同位素内标），然后用内标的定量结果来校正所测信号的原始定量丰度，再进行定量分析和比较。此外，内标加入还有一个作用：考察内标的RSD值，评价实际样本检测过程中的稳定性，如下图所示：
02 检测结果，不能只看定量数值
大家是否想过一个问题，如果PRM的定量结果仅表现为Excel表格中的一串定量数字，我们如何判断这个数字不是随意编写的，甚至经人为随意改的？关于这个问题，《MCP》的guideline也给了明确的指导，而且是非常严肃的要求：
图中标记处，指出：提交定量数据时，一定要同时提交色谱结果。再注意下划线部分（guideline全文只有在这个地方有下划线），如果没有提交的，会直接拒稿！！所谓的色谱图通常就是下面这个：
色谱图是原始结果，是难以伪造的，审稿人看后就明确知道：子离子的保留时间重叠情况、峰型好不好、有没有杂峰，信噪比如何、响应是否理想等等，从而判断离子峰的选择是否合理、定量积分是否准确，最终评价你提供的定量值是否可靠、准确。所以，色谱是非常关键的判断依据，这个必须要有。
以我们多年的蛋白质组及PRM文章发表的经验，强烈建议：
1. 做完蛋白质组，要及时对结果做验证。等审稿人要求再补实验的，就等于给自己挖坑。对于验证技术，推荐PRM技术，其已被广泛认可和接受，且应用范围广、便利性高；
2. 作为靶向技术PRM之所以被认为是更准确、更可靠，并被用于组学结果的验证，是以其重现性、准确性为基础的。所以PRM方法建立过程中，要注意考查方法的重现性，定量过程中要加内标做校正。对于只做建立，而不做评价和校正的PRM方法，建议谨慎使用，被审稿人质疑的风险很大；
3. 拿到结果，不能只看Excel表中的定量结果，要追溯色谱质谱图。对于不提供色谱图、原始定量结果及计算过程的数据或合作者，请谨慎对待，因为你的结果基本不会被认可。
这两期的【知道】，跟大家讨论了蛋白质组分析和研究中大家容易忽视的一些问题。下期开始我们聊聊代谢组。从技术层面上来说，代谢组是最复杂、难度最高的组学技术。因此，大家做分析和项目时，如果有些问题我们不【知道】，掉“坑”系数会非常高。敬请期待下期【知道】：起底最难组学——代谢组！
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2019-09-17
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