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文献解读 | Circulation:哈佛大学医学院研究团队揭秘慢性肾病患者动脉粥样硬化风险增加新机制

2020-02-14
中科新生命
2110

人口老龄化和糖尿病的增多,导致慢病肾脏病(CKD)大规模流行,已成为全球最大的健康威胁之一;我国CKD的发病率高达10.8%(约1.3亿),其中近3000万患者将发展成终末期肾脏病。近年来研究发现,CKD会增加心血管疾病(CVD)的发病率和死亡风险。CKD患者中,冠状动脉疾病、外周动脉疾病和中风在内的动脉粥样硬化(AS)类疾病风险较高,但传统CVD危险因素(高血压、糖尿病、血脂异常等)无法解释其原因。

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Uremic Toxin Indoxyl Sulfate Promotes Pro-Inflammatory Macrophage Activation Via The Interplay of OATP2B1 and Dll4-Notch Signaling.

2019年,来自哈佛大学医学院的研究团队在心血管顶刊Circulation (IF=23.054)上在线发表“Uremic Toxin Indoxyl Sulfate Promotes Pro-Inflammatory Macrophage Activation Via The Interplay of OATP2B1 and Dll4-Notch Signaling”的研究成果,揭示了CKD引起AS的潜在新机制。

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相关背景知识简述

◆ AS过程以炎性巨噬细胞激活为特征

◆ 硫酸吲哚酚硫酸盐(一种色氨酸代谢的尿毒症毒素)是CKD心血管疾病发病率和死亡率的独立危险因素(具体机制,未知)

◆ 肾小管上皮中,硫酸吲哚酚通过有机阴离子转运蛋白(OAT)和有机因子转运肽(OATP)从血液排至尿液(但是否存在巨噬细胞,未知)

◆ 硫酸吲哚酚可诱导内皮细胞促炎反应(但是否作用巨噬细胞,未知)

02

技术路线图

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03

研究结果

表型验证:硫酸吲哚酚可诱导人原代巨噬细胞(PBMC)促炎因子分化

为验证硫酸吲哚酚促进血管炎症的假设,作者首先检测了硫酸吲哚酚处理后的PBMC中促炎因子(IL-1β、TNF-α、MCP-1)和抗炎因子(MRC1、AMAC1、IL-10、CD163)转录水平变化。发现硫酸吲哚酚以剂量依赖性诱导促炎因子表达,并在4%白蛋白培养基(模拟人类血清)培养的PBMC中得到证实,而硫酸吲哚酚来源的色氨酸无上述激活作用(图1)。

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机制探索(1):探究巨噬细胞对硫酸吲哚酚的诱导响应机制

a. 对文献报道进行验证

作者首先检测了PBMC中OAT和OATP表达(由SLCO超家族基因编码),并通过SiRNA沉默策略证实SLCO2B1/3A1/4A1可影响PBMC中吲哚酚硫酸盐对IL-1β和MCP-1诱导;并通过小鼠腹腔巨噬细胞进行同样实验,结合临床OATP抑制剂(丙磺舒、利福平和环胞霉素A)处理PBMC等实验证实SLCO2B1的基因产物(OATP2B1)介导了吲哚酚硫酸盐的摄取,促进PBMC促炎性激活(图2)。

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b. 发现新机制(核心结果)

作者采用TMT蛋白组学策略,对吲哚酚硫酸盐处理不同时间的巨噬细胞系(RAW264.7)进行分析,共发现4178个蛋白。作者进一步对定量到的蛋白质表达量进行聚类,并与疾病表型进行互作网络分析,从中发现6个早期互作网络。其中Notch信号通路变化最为显著(图3)

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作者进一步检测PBMC中Notch信号同理成分表达及信号通路激活情况。作者通过PCR、WB、流式细胞术和免疫荧光等实验证实。硫酸吲哚酚处理后,可在30分钟内迅速增加D114蛋白,且在3小时增加Notch1累积(图4)

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机制探索(2):硫酸吲哚酚作用机制(OATP2B1-USP5-D114-Notch信号)

a. 作者通过γ-分泌酶抑制剂DAPT(泛Notch信号抑制剂)干预,发现其可抑制吲哚酸硫酸盐对PBMC中IL-1β、TNF-α和MCP-1的诱导(图5)。

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b. 进一步进行D114 SiRNA和中和抗体干预实验,发现干预后可降低PBMC中吲哚酸硫酸盐的诱导作用(图6)。

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c. 接着,作者发现利用SiRNA策略沉默SLCO2B1(OATP2B1),可抑制吲哚酚硫酸盐处理后PBMC中对D114蛋白表达和Notch靶基因Hes1转录的诱导(图7)。

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d.作者发现,吲哚酸硫酸盐处理后,可迅速增加D114蛋白水平表达,而且mRNA水平无变化(图8-1)。因此,作者提出假设:吲哚酚硫酸盐通过抑制泛素蛋白酶体途径抑制D114降解。作者重新分析了蛋白组学数据,并结合实验证实硫酸吲哚酚可通过抑制泛素蛋白酶体途径,增加去泛素酶USP5并抑制D114蛋白降解(图8-2)

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转化潜能:阻断D114可减弱CKD小鼠动脉粥样硬化进展

作者首先检测了CKD小鼠中Notch信号激活情况,通过免疫荧光染色证明AS病变部位中更多巨噬细胞表达D114,从而进一步引起Notch信号激活。进一步在模型中给予D114中和抗体,发现可以减轻CKD小鼠的AS疾病进展,并减轻炎症反应(巨噬细胞累积)(图9)

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04

小结

本研究深入解析了硫酸吲哚酚诱导人原代巨噬细胞炎性激活、并加速动脉粥样硬化的病理机制。作者通过TMT蛋白组学技术,结合深度生信分析找到硫酸吲哚酚下游关键信号通路(Notch),并围绕Notch激活机制及下游信号通路展开体内外实验反复论证,阐明CKD引起动脉粥样硬化疾病的关键机制(OATP2B1-USP5-D114-Notch)。此外,作者还针对其中关键靶点D114蛋白,从SiRNA、中和抗体两个层面证实干预后可缓解CKD小鼠动脉粥样硬化进展及其炎症激活。并在最终在利用巨噬细胞靶向的脂质纳米颗粒包裹SiRNA,在动物体内实验对CKD小鼠AS类疾病的外源性干预,为临床药物靶点研发和诊疗提供了理论基础。