磷酸化与蛋白质组学分析：阿尔茨海默病进展分子网络
2020-02-18
中科新生命
3071阿尔茨海默病（AD），号称全球十大死因之一，是最常见的神经退行性疾病，主要表现为认知障碍（占痴呆症病因的50%-75%），且发病率随年龄增长显著增加。目前临床治疗手段仅能维持或减缓认知能力衰退的速度，而其发病早期临床隐匿的特点更使其诊疗雪上加霜。目前已知的两个病理特征是β淀粉蛋白沉积形成的细胞外老年斑和Tau蛋白过渡磷酸化形成的神经细胞保内神经原纤维缠结，但其机制尚不完全清楚。因此，深入探索AD的早期和中晚期病理机制特征，可望帮助研究人员更好地了解疾病，击退病魔。
为解决上述问题，来自美国的研究人员对人类脑组织进行深度蛋白组学和磷酸化组学分析，整合多个组学数据集共同揭示了AD进展过程中新的蛋白和分子网络。作者进一步比较脑组织和脑脊液蛋白质组，确定了候选的生物标记物。这一研究成果于今年1月发表于Neuron上（IF: 14.403）。
Deep Multilayer Brain Proteomics Identifies Molecular Networks in Alzheimer’s Disease Progression.
技术路线
研究结果
1. AD发展进程的深度蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析
研究人员从100例人额叶皮质样本中选择了90个高质量样本，并划分为5个组别：
（1）LPCs（对照组）：老年斑和神经原纤维缠结程度较低；
（2）HPCs（对照组）：Aβ病理学高但无明显认知缺陷；
（3）MCI（实验组）：Aβ病理程度轻微其具有轻度认知损伤；
（4）AD（实验组）：晚期AD伴老年斑和神经原纤维缠结程度较高；
（5）PSP（实验组）：另一种神经退行性Tau病—进行性核上性麻痹。
研究人员对这些额叶皮质样本进行了深度TMT蛋白组学分析，一共鉴定到了14513个蛋白。蛋白组学分析中，共获得173个差异蛋白，Aβ蛋白水平与病理结果基本一致。聚类分析、主成分分析和相关性分析进一步支持了数据的可靠性。研究人员又分别进行了WCGNA分析、互作网络分析以及通路分析来解析蛋白组的表达规律以及分子网络变化特征；并使用WB进行了数据验证。
但是，研究人员的验证之路还没有结束。他们又在两个新的队列Banner Sun（n=49）以及Mount Sinai(n=80)里面去做了TMT蛋白组学来验证：有58个差异蛋白在两个对列里均得到了验证。
为进一步验证脑组织检测到的差异蛋白质可否作为脑脊液（CSF）中潜在的疾病标记物应用于临床，研究人员在Banner Sun队列里选择了18个CSF样本再次进行蛋白质组学分析。结果显示，有8种蛋白在脑组织和CSF中变化一致。其中4种已有报道，其余的4种蛋白（SLC39A12、SLC5A3、SLIT2和STEAP3）可以作为新的候选生物标志物。
2. 磷酸化组学数据分析AD中的激酶活性
TMT磷酸化蛋白组分析一共鉴定了7083个蛋白上的34173个磷酸位点，其中有来自398个蛋白的873个磷酸化肽段差异表达。微管相关蛋白Tau在AD组中的磷酸修饰水平最高。聚类分析结果也显示出AD组的磷酸化蛋白质组变化最为剧烈。
WCGNA分析显示，蛋白质磷酸化在AD的不同阶段是高度动态变化的。通路分析揭示了AD中剪接功能障碍和钙假说途径。值得注意的是，差异磷酸化修饰与差异蛋白只有只有11个重合，表明磷酸蛋白质组分析代表了一个新的分子调控层面，可以对蛋白质组的全景信息进行补充。
接下来，研究人员利用IKAP机器学习算法推断出186种激酶的活性，其中28种可能发生变化，主要发生在AD组。该列表基本上涵盖了所有已知的Tau激酶。最终，研究人员在蛋白质组和磷酸蛋白质组分析了这28个激酶及其相关家族成员的表达水平。
尽管绝大多数激酶（除了MAP3K6）在蛋白质水平上没有变化，但MAPK级联通路中表现出明显的磷酸化修饰水平上调，包括：MAP4K、MAP3K、MAP2K和MAPK。MAPK信号负调节因子DUSP6在AD组中显著降低。这些结果验证了前人的研究结论：MAP激酶信号的激活与AD的发病机制有关（(Kim and Choi, 2010）。
3. Aβ相关蛋白的改变以及人与小鼠的比较
为了探讨Aβ积累引起的分子事件，研究人员在Banner Sun和Mount Sinai队列的蛋白质组结果中，特别关注了28个Aβ相关的差异蛋白。
那么在小鼠中，这28种重点关注蛋白会不会也有同样的表现呢？作者对5xFAD和野生型（WT）小鼠（3、6和12个月龄）皮层组织进行TMT蛋白质组分析发现，28种Aβ相关的差异蛋白中有23种在小鼠中被鉴定到，15种持续增加，其中4种与RNA上调相关，这表明5xFAD小鼠中大多数Aβ相关蛋白受转录后机制调控。
将小鼠差异蛋白质（5xFAD/WT）与人类组织差异蛋白质（HPC/LPC、MCI/LPC和AD/LPC）进行对比，结果表明：5xFAD表现出与AD晚期相似的蛋白质组特征，但表现出自噬和干扰素反应的激活，并且缺乏人类特有的有害事件，例如神经营养因子和突触蛋白的下调。
4. 淀粉样斑块病理进程中的重要通路和蛋白排序
在这项研究中，研究人员以系统生物学的理念整合了主要维度的7个AD数据集（MCI蛋白质组、AD蛋白质组、磷酸蛋白质组、聚集蛋白质组；全基因组关联分析；转录组；蛋白相作组），使用顺序统计和基因集富集分析（GSEA）对基因和/或蛋白质和途径进行等级排序。蛋白排序中，APP、APOE和MAPT为前3位，与目前对AD发病机制的理解一致。GSEA对信号通路进行了优先排序，确定了16条通路，共分为4大类：淀粉样蛋白和Tau通路、炎症、生长发育以及代谢和膜转运。此外，亚细胞定位分析表明，在AD中，分泌子体和细胞表面子体受到特别的干扰，可能对细胞通讯产生强烈的影响。
免疫组化实验、免疫荧光分析和亲和结合实验结果表明：4种Aβ相关蛋白（MDK、NTN1、SMOC1和ICAM1）与Aβ40淀粉样斑块共定位，MDK和NTN1显示直接的Aβ结合，暗示它们可能在AD脑中共同发挥作用。
小结
本研究通过利用质谱技术深度分析了人脑组织的蛋白质组与磷酸化修饰蛋白组，用以表征AD进展阶段相关的分子网络特点，获得了参与17个途径的173个差异蛋白。随后，在两个独立的队列中验证了差异蛋白质的变化，并在脑脊液样本再次利用蛋白组学策略进行验证，筛选获得了新的候选生物标志物。结合小鼠模型分析，研究人员确定了人和小鼠均呈现差异的15个Aβ相关蛋白。5xFAD小鼠模型表现出与症状性AD相似的蛋白质组特征，但存在自噬和干扰素反应的激活，并且缺乏人类特有的有害事件。在多组学整合中，优先考虑了与AD相关的蛋白和途径，包括淀粉样级联、炎症、补体、WNT信号、TGF-b和BMP信号、脂质代谢、铁稳态和膜转运。后续验证结果显示，4种Aβ相关蛋白与淀粉样斑块共定位。这也说明了，多个组学整合分析策略可用于在AD进展过程识别蛋白质分子网络。
