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J HEPATOL | 贝勒医学院和国家蛋白质中心秦钧教授团队揭示肝功能障碍和代谢性疾病潜在新靶点

2020-04-01
中科新生命
2714

肥胖与胰岛素抵抗、2型糖尿病、肝脏及心血管疾病、癌症的发生发展息息相关,是全球重大公共卫生问题。肝脏中胰岛素敏感性在糖脂代谢调控中具有重要作用:正常状态下,胰岛素可以通过抑制糖原分解和糖异生并刺激糖原生成、糖酵解和脂肪生成来抑制葡萄糖生成;而在胰岛素抵抗状态下,胰岛素无法调节脂质和碳水化合物代谢就会导致高血糖和血脂异常,从而加重肝脏疾病 (非酒精性脂肪肝 (NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎 (NASH)、肝硬化以及肝细胞癌) 的风险。除此之外,肝脏疾病又会促进糖尿病的发生发展,但其相关的分子机制仍未知。

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近日,哥伦比亚大学强力教授、Pajvani 教授以及贝勒医学院和国家蛋白质科学中心-北京 (凤凰中心) 的秦钧教授等利用转录因子亲和富集和LC-MS/MS的技术方法研究小鼠肝脏中导致胰岛素抵抗的内源转录因子,并证实抑制造血免疫的关键转录因子PU.1可改善代谢功能障碍和非酒精性脂肪肝炎,可作为肝功能障碍和代谢疾病新的治疗靶点,相关研究成果在Journal of Hepatology  (IF= 18.946) 杂志上发表了题为 Inhibition of PU.1 ameliorates metabolic dysfunction and non-alcoholic steatohepatitis 的研究论文。

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Journal of Hepatology  (IF= 18.946)

 

技术路线图:

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主要研究结果:

1.     肝脏PU.1在饮食诱导高脂饮食小鼠中上调

首先作者通过定量蛋白质组学技术系统性分析了可导致肥胖引起的代谢综合征的肝脏转录因子 (1A)。基于前期开发的转录因子富集方法分析精瘦和肥胖小鼠肝脏中内源表达的转录因子,发现上调显著的为髓样细胞活性的主要调节剂PU.1/SPI1 (1B);同时发现Pu.1在饮食诱导肥胖 (DIO) 的小鼠肝脏中上调~5(1C)

为确定肝脏中上调PU.1来源,进一步从C57BL/6J野生型小鼠肝脏中分离得到实质细胞 (PCs) 和非实质细胞 (NPCs),结果发现尽管在DIO小鼠中肝细胞Pu.1上调约3.6倍,但Pu.1主要在NPCs细胞中表达 (主要为巨噬细胞和B细胞,图1F)。肝脏T细胞和星状细胞 (HSCs) DIO小鼠肝脏Pu.1表达无显著影响 (1F-G)。因此,肥胖小鼠肝脏中PU.1增加主要来源于肝细胞Pu.1表达量及巨噬细胞数量增加。

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1 转录因子PU.1DIO小鼠肝脏中上调

2.     肝脏PU.1对遗传性/饮食引起肥胖小鼠葡萄糖稳态的调控作用

1)    DIO小鼠肝脏Pu.1敲减可改善葡糖糖稳态

通过构建针对Pu.1shRNAs进一步探索PU.1在肝脏代谢中的功能,发现Pu.1敲减不会影响小鼠体重,但会降低空腹血糖浓度、改善葡萄糖耐量并抑制糖异生关键调节因子Pck1的表达。敲减小鼠肝脏比对照组稍大,但肝脏中甘油三酯 (TG) 和胆固醇以及血浆中脂质和丙氨酸转氨酶 (ALT) 的浓度未发生显著变化,说明肝脏中PU.1敲减对脂肪组织影响较小。

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2 Pu.1敲减改善DIO小鼠葡萄糖稳态

2)    肝脏敲减Pu.1可改善糖尿病db/db小鼠血糖控制

作者进一步在遗传性肥胖/糖尿病小鼠模型 (瘦素受体缺陷型db/db小鼠) 中研究PU.1的表达量,为了提高准确度,使用全扫描的SWATH模式对db/db小鼠肝脏中Pu.1的表达量进行分析,发现与对照组相比,在db/db小鼠肝脏组织中Pu.1的表达量显著上调,与饮食诱导的肥胖模型一致 (3A-B),表明PU.1可能作为db/db小鼠有益的干预靶点。与前部分研究工作类似,作者发现Pu.1敲减对小鼠体重及血浆胰岛素和TG含量无显著影响,却显著降低空腹血糖浓度,改善db/db小鼠葡萄糖耐量并降低Pck1表达量 (3C-I)。综上,肝脏PU.1db/db小鼠和DIO小鼠葡萄糖稳态失调的重要因素。

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3 Pu.1敲减改善db/db小鼠葡萄糖稳态

3、  巨噬细胞在PU.1调控肝脏炎症中的重要作用

1)    肝脏特异性敲除PU.1对葡萄糖代谢无显著影响

由于Pu.1DIO肝细胞中显著高表达,并且肝细胞是肝脏中唯一的葡萄糖生成细胞,作者进一步解析Pu.1敲减的降糖作用是否由于肝细胞PU.1降低所致,因此构建了肝脏特异性Pu.1敲减小鼠。发现上述小鼠葡萄糖耐量未受影响,与AAV8-TBG-GFP对照组小鼠相比,高脂饮食喂养的Pu.1敲减AAV8-TBG-Cre小鼠葡萄糖耐量或胰岛素敏感性均未发生显著变化 (4A-C)。最后将Pu.1flox/flox小鼠与Alb-Cre小鼠杂交,得到肝细胞特异性敲除PU.1 (不会影响NPC Pu.1表达,图4D-E)。高脂饮食喂养3个月后,基因敲除小鼠的体重、葡萄糖耐量以及胰岛素敏感性与对照小鼠相近 (4F-H)。上述结果表明Pu.1敲减改善葡萄糖稳态不是由于肝细胞Pu.1基因缺失引起的。

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4 肝细胞特异性敲除PU.1对代谢活动无影响

2)    巨噬细胞中PU.1敲减降低db/db小鼠肝脏炎症

该部分研究de 主要目的为研究巨噬细胞PU.1在调节肝脏代谢功能中的作用。当巨噬细胞Pu.1表达下调>80%时,Pu.1敲减会降低Kupffer细胞 (KCs)、单核细胞衍生巨噬细胞 (MoMFs) 以及整个肝脏中促炎基因的表达 (TnfaIl-6Il-1b,图5A-C);与之对应,肝脏中TNFαIL-6蛋白水平均降低 (5D)。进一步地,作者使用脂多糖 (LPS) 处理了骨髓衍生巨噬细胞,用于刺激炎症反应,发现PU.1表达量上调3.5(5E),与前期DIOdb/db小鼠肝脏中上调倍数相近;并且,使用PU.1抑制剂DB1976处理细胞后,可显著抑制炎症标志物TnfaII-6 (5E)。该部分研究结果表明PU.1可调节巨噬细胞炎症反应,并且PU.1敲减可缓解肝脏炎症、改善葡萄糖稳态

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5 抑制PU.1可抑制肝脏巨噬细胞炎症反应

4、  PU.1可作为肝脏疾病潜在的治疗靶点

1)     DB1976抑制PU.1可改善DIO小鼠代谢功能障碍

肝脏巨噬细胞PU.1敲减可改善葡萄糖稳态以及肝脏炎症,作者认为PU.1可能作为代谢疾病新的治疗靶点。通过后续验证实验发现,PU.1抑制剂DB1976可降低空腹血糖浓度和胰岛素水平,从而使DIO小鼠糖耐量恢复至正常水平 (6A-C)。同时,DB1976处理小鼠后肝脏糖异生基因G6pcPck1被显著抑制,与空腹胰岛素含量降低结果一致 (6B);并且可减轻小鼠体重。与前期结果一致,PU.1抑制剂处理后会抑制炎症基因,而不会使巨噬细胞浸润发生变化 (6F-G)。但与Pu.1敲减不同的是慢性抑制PU.1可以使DIO小鼠血脂异常得以恢复,并且不会影响肝脏脂肪变性 (6J-K)。该部分研究结果表明DB1976抑制剂处理可达到肝脏Pu.1敲减的效果 (肝脏炎症、高血糖以及葡萄糖耐量),并进一步改善肥胖和脂质代谢

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6 PU.1抑制剂DB1976可改善高脂饮食引起的肝脏功能障碍

2)     PU.1抑制可改善非酒精性脂肪肝炎

NASH的发展进程与胰岛素抵抗和肝脏炎症的发生具有密切关系,因此作者推测PU.1也可作为NASH潜在的药物靶点。首先对C57BL/6J喂食可诱发NASH饮食,分别使用/不使用DB1976处理,发现Pu.1NASH喂食小鼠肝脏中显著上升,DB1976处理后显著降低,并且有效改善其葡萄糖耐量 (7A-B)。与DIO小鼠结果类似,DB1976处理小鼠肝脏脂肪变性和血浆ALT浓度显著降低、炎症基因TnfaII-6II-1b显著下调并且巨噬细胞浸润减弱 (7F-I)。另外,DB1976也可显著抑制纤维化基因表达,并减少肝脏纤维化 (7J-K),同时,也可减轻小鼠体重和肥胖,这与巨噬细胞浸润减弱以及脂肪细胞基因抑制有关。该部分结果表明DB1976抑制PU.1可有效改善多种NASH相关的疾病进程。

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7 PU.1抑制剂可改善NASH小鼠模型

3)     肝脏PU.1表达量与胰岛素抵抗和炎症有关

为了研究PU.1是否与人类胰岛素抵抗有关,作者进一步分析了38位经皮肝穿刺活检样本。结果发现,尽管PU.1的表达量不会随着年龄、BMI、腹围、血浆葡萄糖及胆固醇浓度变化而变化,但作者发现PU.1的表达量和血浆胰岛素水平、HOMA-IR呈现显著正相关 (8B-C)。 在这些受试者中,作者也发现PU.1表达量在NASH患者中上升而未在脂肪变性肝脏患者中上升,并且该变化趋势与TNFA患者中mRNA分析结果一致 (8D-E)。该部分研究结果证明PU.1在肝功能障碍发病进程中发挥重要作用

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8 肝脏PU.1表达与人类胰岛素抵抗和炎症相关

小结:

肥胖是2型糖尿病和非酒精性脂肪肝炎公认的危险因素,但是其潜在的作用机制是未知的。本研究工作首先通过蛋白质组学技术在饮食诱导及遗传性肥胖小鼠模型中发现PU.1/SPI1显著上调,进一步通过选择性敲除小鼠、加入PU.1抑制剂等方式证实PU.1可有效改善DIO小鼠及NASH小鼠体内葡萄糖稳态、肝脏炎症等;最后在临床活检样本中证实肝脏PU.1表达量与胰岛素抵抗与炎症呈现显著正相关。从而揭示造血免疫因子PU.1能够作为肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病以及NASH等疾病的潜在治疗靶点。