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项目文章 | 肝癌相关蛋白解除AMPK抑制,促进肝癌脂肪生成增加

2020-06-18
中科新生命
2048

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球癌症相关死亡的主要原因。据报道,脂肪生成增加在肝癌的进展中起着关键作用。然而,导致肝癌脂肪生成增加的潜在机制仍不清楚。  

上海交通大学医学院附属仁济医院研究团队在《Hepatology》(IF=14.971)杂志发表了题为“Hepatocellular Carcinoma-associated Protein TD26 Interacts and Enhances SREBP1 Activity to Promote Tumor Cell Proliferation and Growth”的研究论文,研究表明,TD26介导的脂肪生成和肿瘤细胞增殖的增加是SREBP1依赖的,TD26与SREBP1的相互作用可以作为肝癌治疗的潜在靶点。中科新生命提供代谢组学服务。

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实验设计

研究材料:肝癌患者的肿瘤组织和正常组织,肝癌细胞系,人肿瘤异种移植模型等

技术方法:代谢组分析(能量代谢),TG和胆固醇分析,芯片分析,qRT-PCR,western blot,Co-IP,IHC染色,IF染色,CCK8,BrdU incorporation assay等

研究路线

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研究结果

TD26在肝癌组织中表达上调,是肝癌预后不良的标志物

对TD26在肝癌和正常对照组织样本的表达量进行qRT-PCR和western blot分析,结果均显示在肿瘤组织中高表达。与先前的一项研究相一致,该研究显示肝癌样本中的TD26转录水平高于正常组织。此外,Gene Expression Omnibus数据库的三项HCC数据,也确认了HCC组织中TD26的上调。结合临床病理分析表明,TD26的表达与肿瘤大小显著相关,作为独立预测因子,与不良总生存率(OS)和无复发生存率(RFS)相关。

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体外实验表明TD26促进肝癌细胞增殖

为了研究TD26的体外功能,选择高表达HepG2和Huh7以及低表达的SMMC-7721和mhc-97L进行TD26基因敲除和过表达实验。CCK8分析表明,TD26的过表达或敲除分别显著促进或抑制相应肝癌细胞的生长。BrdU incorporation assays(细胞增殖定量检测实验)实验表明,TD26高表达的SMMC-7721/MHCC-97L细胞增殖增加,TD26基因敲除的HepG2/Huh7细胞增殖减少。而凋亡水平没有改变。因此,这些体外研究结果表明TD26促进肝癌细胞的增殖。

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体内实验也表明TD26促进肝癌生长

为研究TD26是否能促进肝癌的体内生长。人肿瘤异种移植模型通过皮下注射稳定的TD26过表达或敲除的肝癌细胞。结果表明来自于TD26高表达的SMMC-7721细胞,显示出更大的肿瘤质量,而TD26基因敲除的HepG2细胞显示出肿瘤负担更小。western blot和IHC染色实验表明在TD26高表达的肿瘤,PCNA(增殖细胞抗原) and Ki67(增殖细胞抗原)表达量更高。这些发现表明TD26可能通过增加肿瘤细胞增殖来促进肝癌的生长。

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代谢组学分析表明:TD26与HCC细胞和组织的脂肪生成呈正相关

先前一些研究已经表明TD26参与自噬激活,然而却发现提示自噬与TD26介导的肿瘤细胞增殖无关。由于糖、脂代谢异常被认为与肝癌的发生有关,因此研究团队开始研究TD26对肝癌细胞糖、脂代谢的影响。与先前的研究一致,代谢组学分析结果也表明TD26的过度表达和敲除都不会改变肝癌细胞的糖代谢。相反,TD26高表达的SMMC-7721细胞显示出细胞甘油三酯(TG)、胆固醇(CHE)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)和磷脂酰胆碱(PC)的水平增加,而TD26基因敲除的HepG2细胞显示这些脂质代谢产物的细胞水平降低。此外,胆固醇和甘油三酯比色分析、Oil Red assay、IHC染色实验、ELISA、western blot,均进一步表明TD26与脂肪生成显著正相关。

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TD26作用机制研究

(1)TD26通过增加nSREBP1的表达,增强SREBP1的活性

考虑到TD26与脂肪生成呈正相关,且SREBP1主要负责胆固醇、脂肪酸和甘油三酯的生物合成,所以进一步研究TD26是否影响SREBP1的表达和活性。western blot分析显示,TD26的过表达或敲除分别增加或降低了核SREBP1型(nSREBP1)的表达水平,影响SREBP1的活性以及下游靶基因的表达。

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(2)SREBP1是TD26诱导的肝癌细胞增殖必须的

TD26可以增强SREBP1的活性,那SREBP1的活性是否是TD26诱导肝癌细胞增殖所必需的呢?SREBP1 siRNAs显著抑制SREBP1及其下游靶基因FASN、SCD1、ACC和ACL Y的表达,并消除了TD26引起的肿瘤细胞增殖效果。SREBP1抑制剂也产生了类似的结果。综上所述,这些发现表明SREBP1的活性是TD26介导的肝癌细胞增殖增加所必需的。

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(3)TD26与nSREBP1相互作用,阻断AMPK介导的对SREB1的抑制

先前的研究表明AMPK可以与SREBP1相互作用,抑制其加工和核移位。研究团队试图研究TD26是否会影响AMPK和SREBP1之间的相互作用。在SMMC-7721细胞中TD26的过度表达明显减弱了AMPK和nSREBP1之间的相互作用,而在HepG2细胞中TD26的敲除明显增强了这种相互作用。进一步通过co-IP分析、IF染色等实验,进一步的证实了,TD26通过与SREBP1相互作用,阻断了AMPK和nSREBP1之间的相互作用。

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(4)TD26与nSREBP1的相互作用,对TD26介导的肝癌细胞肿瘤进展至关重要

进一步探讨TD26诱导肿瘤增殖是否需要TD26和nSREBP1的相互作用,CCK8分析、BrdU掺入试验、异种移植小鼠模型等实验,研究表明TD26和nSREBP1之间的相互作用是TD26诱导肝癌细胞增殖所必需的。

小编总结

研究团队首先在肝癌组织中观察到TD26高表达,并通过临床病理分析,发现TD26的表达与肿瘤大小呈正相关,是肝癌患者总生存率(OS)和无复发生存率(RFS)的独立预测因子。体内外实验检测表明TD26促进了肝癌细胞的增殖和肿瘤的生长。代谢组学分析表明TD26对肝细胞癌细胞的糖代谢没有影响,但显著增加肝细胞癌细胞的脂肪生成。后续进一步证明了TD26介导的脂肪生成和肿瘤细胞增殖的增加是SREBP1依赖的。该研究表明TD26是一种新的SREBP1正向调节因子,TD26与SREBP1的相互作用可以作为肝癌治疗的潜在靶点。

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