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大咖讲座精华回顾| 外泌体那些不可错过的干货

2020-09-29
中科新生命
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近年来,外泌体蛋白质组学的研究成果进展迅速,蛋白质分子在外泌体信号传递过程中也起到了非常重要的作用。中科新生命9月23日隆重举办了外泌体专题的系列讲座,得到了大家的热烈响应。现在,我们总结了讲座的精华内容及回放视频,包括报告中的问题也提供了详细文字答疑,供大家参考。

报告一 :外囊泡的蛋白质组、磷酸化蛋白质组学的研究进展

来自于美国普渡大学的陶纬国教授给大家带来一场精彩的报告,报告内容围绕蛋白质分子的临床标志物重要性及挑战,细胞外囊泡进行治疗及诊断标志物的应用潜力,外泌体蛋白质组学及磷酸化组学方法流程,EVTRAP外泌体磷酸化及糖基化提取方法等方面展开。在外囊泡的诊断应用案例中,陶老师重点介绍了尿液细胞外囊泡在阿尔兹海默症中研究进展,主要利用磷酸化蛋白质组学技术进行标志物筛选。

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报告二 :外泌体蛋白质组学研究难点及解决策略

中科新生命产品经理高晓静主要围绕外泌体蛋白质组学的近期研究进展,外泌体蛋白质组学实验设计的关键要素,以及外泌体蛋白质组学的案例应用等方面展开报告。详细介绍了外泌体蛋白质组学的实验设计思路,外泌体样本准备要求,蛋白质组学技术选择以及经典案例,可为老师开展外泌体蛋白质组学提供参考。

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报告三 :细胞外囊泡 (EVs) 生物标志物研究现状与开发实践

南方医科大学、国际细胞外囊泡学会执行主席郑磊教授分别从EVs标志物研究现状、开发实践、挑战、展望等四个方面展开报告。

在研究现状分享中,郑教授表明“EVs是具有广阔应用前景的生物标志物”,目前EVs蛋白作为标志物在已在诸多疾病,如肿瘤、神经退行疾病、心血管疾病等中具有诊断、预后判断等重要价值。

随后郑教授提到,基于多种不同组学的技术发展,以及基于不同样本(如细胞、组织、血液)来源的EVs研究,推动了EVs中不同成分作为潜在标志物应用的发展,并分享了其多项肿瘤EVs研究工作。最后,郑教授也表示EVs研究中存在诸多困难,包括:挑战一,细胞外囊泡亚群难以分选;挑战二,缺乏理想检测技术平台;挑战三,细胞外囊泡溯源不清,难以标准化。当然,这些挑战也是未来领域发展及值得展望方向,包括:发展特定EVs亚群得高通量分选技术;对单个EV绝对定量检测技术;组织EVs与循环EVs联合筛选策略等等。


报告四 :细胞外囊泡常见的提取检测方法及比较介绍

厦门大学颜晓梅教授主要就细胞外囊泡的提取技术研究发展方面带来精彩报告,介绍内容主要包括:EVs分离纯化必要性、检测表征技术、提取方法比较、及纳米流式检测技术的应用。

颜教授表示“EVs异质性大,及其所处生理环境基体十分复杂”,因此提取高纯度EVs是做好后续研究工作前提,为准确研究EVs的生物合成途径及其功能奠定基础。随后,颜教授就EVs表征进行介绍,并提到了纳米流式细胞术在检测粒径分布测定中具有浓度准确测定、同时能表征EV marker、用量少等特点,为EVs应用发展提供了高效的表征手段。

主要介绍了常见EVs分离纯化方法(包括差速离心、聚合物沉淀、尺寸排阻、免疫亲和等)比较,结果发现超离方法提取纯度最高。而基于试剂和提的EVs,尤其基于聚合物沉淀原理试剂盒,获取浓度虽然高,但杂质较多。该项研究工作为选择合适手段纯化EVs提供了一定数据支持。

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报告五 :Cell精读:外囊泡蛋白质组学在标志物研究中的思路介绍

中科新生命产品经理徐文佳以2020年8月发表在《Cell》杂志上的文章“Extracellular Vesicle and Particle Biomarkers Define Multiple Human Cancers”为出发,分别从研究思路、分析技术、研究意义等多个方面,详细介绍了细胞外囊泡及颗粒(EVPs)在标志物研究中四个亮点工作及发现,包括:对不同样本肿瘤类型来源的大规模EVP提取及蛋白组分析;鉴定新外囊泡标志物pan-EVP markers;分析组织血浆不同来源的EVP蛋白特征及EVP肿瘤特异性标志物筛选;筛选用于肿瘤分类EVP标志物。该文章的研究工作发现不同肿瘤组织EVP蛋白特异性,血浆来源肿瘤特异性EVP蛋白具有表征肿瘤及其微环境的系统性变化特点,有力支持了EVP蛋白能够作为肿瘤诊断及分类标志物,并且肯定了血浆EVP蛋白在液体活检未来发展中的潜在重要价值。

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提问解答

Qustions & Answers

网友提问环节,大家也进行了激烈的讨论,在此进行总结分享。

1. 血清和血浆外泌体有何区别?临床样本如何选择?

答:血浆和血清的制备方法有所不同,血清在沉降过程中可能会带有部分损失,且批次间制备的重复性有所差别。此外,对于血清而言,血液样本处理时血小板凝血过程中会分泌大量的外泌体到血清中,故可能干扰所关注疾病来源的外泌体。因此如果条件允许的情况下建议优先先选择血浆进行外泌体提取。但是友情提示一点,血清外泌体也是可以作为实验材料进行后续组学的。

2. 磁珠法富集外泌体的方法原理是什么?

答:主要通过EVTRAP进行富集,主要原理是磁珠表面所偶联的亲水亲脂基团,可以特异性结合外泌体表面所包裹的脂质,从而实现富集的目的。

3. 心肌组织怎么提取外泌体?

答:组织类和体液类提取外泌体的方式差异较大,组织类主要通过消化的方式,获取上清,然后再进行外泌体提取。但是组织中提取外泌体难度较大,如果也可以通过同类细胞进行培养,对培养的上清进行外泌体提取相对较为容易。

4. 细胞上清提外泌体做蛋白质组杂蛋白的污染严重不?

答:在样本准备阶段,当细胞生长一定密度时,更换为无血清培养基或者无外泌体培养基的方式进行上清收集,这样可以避免血清或者其他来源干扰,得到细胞上清外泌体提取一般背景比较干净。

5. 请问磷酸化多肽富集的手段有哪几种呢?

答:一般有抗体法,IMAC或TiO2等方式可进行磷酸化富集。

6. Label free的结果缺失值很多怎么处理的?

答:Labelfree的结果缺失情况一般组间组内的重复情况进行过滤筛选,如果满足一定的标准可以作为有无定量差异进行后续分析;如果在每组中都出现但又有缺失,说明该蛋白稳定性不高,不建议进行后续分析。

7. 分泌蛋白和外泌体蛋白有何区别与联系?

答:两者形成的方式也有所不同,提取方法也有区别。分泌蛋白是在内质网及高尔基体合成的成熟蛋白,穿过细胞膜到胞外发挥作用的蛋白。而外泌体蛋白是外泌体在细胞内形成过程中所包裹的蛋白,里面所携带的蛋白质随生理或病理会有所变化,也可能在正常情况下是在细胞内发挥作用的蛋白。

8. 发现队列要求一般是多少?

答:做标志物研究,筛选队列要避免临床样本个体差异的影响,建议越多越好,一般常见的30-50例,超大队列的研究一般会有上百例甚至几百例。

9. 血清外泌体是不能区分具体脏器来源的对吧?

答:血清本身是全身性循环系统,一般难以区分外泌体来源。

10. 体液样本可以提供测试服务吗?对样本有什么要求?

答:体液样本比如常见的血浆、血清、细胞上清、尿液、牛奶等可以进行外泌体提取及组学服务,具体样本要求及样本准备细节可以联系我们索取。

11. 什么时候选择体液做蛋白组学?什么时候提取外泌体在做组学?有什么区别?

答:体液及体液的外泌体都可以进行组学研究,进行标志物筛选。可以查阅相关研究领域的进展,如果该领域体液类研究也比较少,可以先从体液做起,样本获取简单方便。如果希望有一定的创新性,可以提取外泌体进行研究。

12. 外泌体蛋白的浓度方便测吗?BCA方法可以测吗?

答:外泌体蛋白浓度可以测定,可以通过BCA法检测得到蛋白浓度,进而评估是否足够进行蛋白质组学实验。

13. wb检测外泌体很多用cd63,跟三阳一阴有什么出处吗?

答:外泌体表面有很多特异性蛋白是可以选择的,像CD63,CD81等等都可以阳性检测指标。三阳一阴的含义是三个外泌体特异性表达蛋白和一个外泌体不达标的指标综合判断所提取到的外泌体蛋白特异性。该说法主要来源于国际囊泡协会对于外泌体实验的标准建议,但是对于具体选择哪一个蛋白可以根据实际情况确定。

14. 老师,如果我做外泌体的RNA测序和蛋白组学都筛选出了有用的RNA或者蛋白,那么如何知道到底是哪种成分更起作用呢?

答:如果已经测序到蛋白或者RNA有差异,在数据上您可以先做一些功能分析,看哪些和您关注的表型比较先关,可以选择一种方向继续深入研究,验证一下表达量是否有差异,然后体内外实验进行功能验证。

15. 提取的Ev深低温能保存多久?

答:提取完成以后的外泌体相对比较稳定,如果不反复冻融,放置几个月是可以的。