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Nature重磅: 组学领军大牛Matthias Mann等揭示JAK2突变肿瘤耐受性机制,为后续用药提供指导

2020-12-28
中科新生命
2139

Janus激酶(JAKs)是造血细胞发育至关重要的一个调控激酶。研究发现,JAK基因(JAK2)常常发生突变,其突变组成性激活下游信号转导网络,导致骨髓增生性肿瘤(MPN)等血液疾病发生。临床上,采用靶向激酶抑制剂用药能取得疗效,然而采用JAK抑制剂治疗肿瘤效果却十分有限,这是由于JAK突变的存在导致了疾病持久性。因此,揭示JAK2突变下游的信号通路变化,对于阐明疾病持久性以及指导用药具有重要意义。

2020年11月,来自德国马普所Matthias Mann、耶拿大学附属医院Florian Heide等团队合作,在顶级期刊Nature(IF=42.8)上发表了"Splicing factor YBX1 mediates persistence of JAK2-mutated neoplasms"的文章,通过深度磷酸化蛋白质组、转录组等多种技术方法,筛选到了JAK2突变下游关键靶标YBX1,其受JAK2磷酸化调控,并通过RNA剪切过程参与ERK等信号通路调节,介导肿瘤持久性。针对JAK2抑制结合YBX1依赖信号通路药物联用,能消除JAK2突变肿瘤细胞,提升治疗效果。

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研究材料:

小鼠造血细胞(JAK2WT野生型、JAK2VF突变型);人骨髓(正常人、MPN患者);JAK2突变的YBX1条件敲除小鼠(Ybx1+/+ JAK2VF、Ybx1-/- JAK2VF);小鼠及人骨髓细胞(JAK2WT野生型、JAK2VF突变型)

技术方法:

磷酸化修饰组、RNAi、转录组等

实验线路图:

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实验结果

1. 磷酸化修饰组 & RNAi:筛选JAK2突变下游的关键变化通路和蛋白YBX1

为了找到JAK2突变下游的效应分子,采用深度磷酸化修饰组分析了野生型JAK2(JAK2WT)与突变体JAK2-V617F(JAK2VF)小鼠造血细胞中的磷酸化变化。实验共鉴定到21764个磷酸化位点、4135种磷酸化蛋白,其中1758个蛋白上5191个磷酸化位点发生差异变化,包括一些JAK已知靶点,如STAT、PIM、ERK等。GO功能分析发现,这些修饰蛋白在mRNA剪切加工过程富集,表明该过程可能参与到JAK2突变引起的肿瘤持久性疾病特征中。进一步筛选关键靶标蛋白,采用RNAi敲低上述过程中15个变化最显著的蛋白,利用细胞存活实验分析它们发挥的作用。结果筛选到一个关键靶标——mRNA核心剪切因子Y-box-binding protein(YBX1),在JAK抑制剂处理条件下,其敲低引起JAK2突变细胞生长及活力下降。综上表明, YBX1是JAK2突变下游的关键靶标蛋白。

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2. 探究YBX1功能:YBX1介导JAK2突变细胞的持久性,对YBX1抑制会诱发突变细胞凋亡

为了证明YBX1参与了MPN肿瘤的发生发展,首先比较了正常人骨髓与JAK突变MPN患者骨髓中YBX1表达情况,发现MPN患者骨髓中YBX1呈现高表达。进一步探究YBX1在JAK2突变中发挥功能,发现YBX1与JAK2突变体能发生相互作用,且在JAK抑制剂处理条件下抑制YBX1功能,发现无论JAK2突变人还是小鼠细胞均有细胞生长受损、凋亡现象。综上表明,YBX1介导了JAK2突变细胞的存活和持久性,在JAK抑制剂处理下对YBX1抑制能引发突变细胞凋亡。

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进一步,作者猜想YBX1抑制引发凋亡可为改善疾病治疗提供依据。为证明可行性,构建了YBX1条件敲除小鼠,随后分别取YBX1敲除的(Ybx1+/+ JAK2VF)以及YBX1表达的JAK突变小鼠(Ybx1-/- JAK2VF)骨髓进行移植实验,并对移植受体小鼠进行疾病特征分析。结果显示,移植YBX1敲除骨髓的受体小鼠并未表现出血液疾病相关特征,但移植YBX1正常表达骨髓的受体鼠则表现出白细胞血症、血小板增多等一系列疾病症状。同时,在JAK2突变人细胞上也进行了异种移植实验,得到了相似结论。

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3. 解析YBX1的调控机制:JAK2突变调控YBX1磷酸化,影响ERK通路中MKNK1蛋白的mRNA剪切和转录

为分析JAK2突变如何调控YBX1,挑选JAK2下游已知靶标进行抑制,利用磷酸化组分析YBX1变化,结果发现MAPK信号中的MER、ERK抑制使YBX1的S30、S34残基发生显著磷酸化变化,深入功能分析发现,YBX1与MAPK1能发生相互作用,且JAK2-MAPK调控YBX1磷酸化会进一步影响YBX1入核。

为深入分析YBX1如何调控下游转录过程,对YBX1敲低后JAK2突变细胞进行转录组分析,GO功能分析发现炎症、MAPK、ERK等过程显著富集,其中ERK通路中关键蛋白的表达MKNK1发生mRNA表达显著下调。结合YBX1功能是调控RNA剪切,并影响内含子保留、mRNA表达,采用剪切抑制剂抑制mRNA剪切过程,发现MKNK1表达依赖于Mknk1 高效剪切,且表达YBX1磷酸化位点突变体会抑制Mknk1转录。综上表明,JAK2突变-MAPK调控YBX1磷酸化影响其入核,而YBX1的磷酸化变化则通过影响mRNA高效剪接过程调控MKNK1转录。

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4. 靶向MKNK1-ERK 信号通路、揭示其治疗价值

由于在磷酸化组分析中,发现JAK2突变下游诸多磷酸化变化底物与ERK信号通路相关,且MKNK1被证明是ERK相关靶点。故进一步分析了JAK2突变中YBX1对MKNK1-ERK 信号通路影响,结果发现,对YBX1抑制后会影响ERK磷酸化变化。同时,在JAK抑制剂处理下,敲低MKNK1会抑制ERK信号通路并导致细胞死亡。综上表明,YBX1通过调控MKNK1转录表达,参与到ERK信号通路的调控。基于以上结论,采用MKNK1或ERK信号的调节剂与JAK抑制剂结合使用,发现药物联用能够诱导小鼠及人的JAK2突变骨髓细胞的凋亡,且在异种移植模型实验中,能抑制JAK2突变肿瘤细胞增殖,减少疾病特征表现。

总结

通过深度磷酸化蛋白质组结合RNAi筛选,找到了JAK2突变下游关键靶标YBX1,进一步机制研究发现YBX1受JAK2的磷酸化调控,并通过RNA剪切过程参与ERK等信号通路调控,介导肿瘤持久性。在JAK抑制剂处理条件下, 对YBX1抑制能导致mRNA错误剪切、ERK信号通路紊乱,引起细胞凋亡。基于此,将JAK2抑制结合YBX1依赖的信号通路的药物联用,能够消除JAK2突变肿瘤细胞,为改善JAK2突变肿瘤治疗效果提供后续用药指导。

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