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中医药与肠道菌群 | ART:中药方剂黄连解毒汤治疗阿尔茨海默病的机理研究

2021-05-17
中科新生命
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肠道菌群是近年来中医药领域的研究热点,不仅与中医理论相契合,而且是中药口服发挥药效的重要靶点之一。基于肠道菌群的中药药理研究近年来也陆续刊登于核心期刊。

为了帮助广大研究者了解中医药相关肠道微生物的研究进展与方法,我们收集整理了近几年基于中药及肠靶轴研究的发表于GUT、Nature Communications、Theranostics等高水平期刊的论文。

【中医药与肠道菌群专辑】为大家精细解读重磅研究与进展。

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Huanglian Jiedu decoction remodels the periphery microenvironment to inhibit Alzheimer's disease progression based on the "brain-gut" axis through multiple integrated omics

【杂志名】:Alzheimer's Research & Therapy

【影响因子】:IF=6.11

【中药单体】:黄连解毒汤

【疾病】:阿尔兹海默症

【样本类型】:Tg-APP / PS1小鼠

【技术方法】:非靶向代谢组学、脂质组、靶向代谢组学(神经递质、不饱和脂肪酸、胆汁酸)、16S

【关键菌群】:SCFAs-producing bacteria, Porphyromonadaceae, Odoribacter, Bacteroides, Prevotellaceae Lactobacillus, Lachnospiraceae

【是否菌群验证】:无


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研究背景

【中药背景】黄连解毒汤(HLJDD)是黄连、黄芩、黄柏和栀子组成的解热解毒经典中药方剂,广泛应用于脑血管疾病、缺血性中风、阿尔兹海默症(AD)的治疗。前期研究在HLJDD中鉴定出69种化合物,主要包括环烯醚萜、生物碱和黄酮类,其中小檗碱和黄芩苷等是代表性成分。黄连解毒汤(HLJDD)及其成分在治疗AD的药理作用方面取得了良好的效果,如改善认知功能障碍、减轻斑块积累和氧化应激及改变脂质代谢。然而,HLJDD改善AD的潜在机制仍未知。

【疾病和肠道菌群】阿尔茨海默症是一种慢性神经退行性疾病,全世界超过4000万人患有AD,目前仍无治疗和预防的有效手段。多靶点干预为AD药物开发提供新思路,而具有多成分、多靶点特点的中药在AD治疗中逐渐被应用。

神经炎症是AD神经变性过程中的关键因素,而微生物多样性的改变也会影响AD临床前模型中神经炎症发生发展。肠道菌群可激活迷走神经影响免疫系统,进而触发与中枢神经系统的双向通信,并将它们与大脑的认知和情感中心建立联系。此外,肠道菌群失调会引发肠道和血脑屏障渗透性增加,其产生的短链脂肪酸(SCFA)及多种具有神经活性和免疫调节作用的物质还可调节大脑的发育和行为。

外周和中枢炎症在AD的发病机理中起重要作用,基于“脑肠”轴假说解析其机制是一个有益和有前景的探索方向。中医科学院研究团队通过揭示APP / PS1阿尔兹海默症小鼠的表型特征,解析中药黄连解毒汤对AD病理状态改善作用的潜在机制,相关研究成果发表于AD领域权威期刊《Alzheimer's Research & Therapy》。

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实验设计

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主要结论

1. 小鼠的认知缺陷、病理与药物作用

(1)行为测试:navigation test、space probe test证实,与年龄匹配的野生型(WT)小鼠相比,Tg-APP / PS1(Tg)小鼠的认知功能明显受损。

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(2)Aβ斑块沉积:刚果红染色与免疫组化发现,Tg小鼠的大脑皮层和海马淀粉样蛋白(Aβ)斑块明显积聚(图A-B)

(3)过氧化水平:脑组织超氧化物歧化酶(SOD)含量显著降低。

(4)药物治疗效果:口服H-L (HLJDD低剂量)和H-H (HLJDD高剂量)4个月,皮层和海马中Aβ斑块的积累减少,Tg小鼠的记忆和空间学习缺陷显著改善(图C)。H-L可使Tg小鼠脑SOD水平升高,并下调丙二醛(MDA),提示HLJDD能减轻氧化应激(图D)。

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2. 中枢神经系统神经紊乱与药物作用

(1)脑组织的炎症因子表达变化

与WT小鼠相比,Tg小鼠的IFN-γ和IL-12p70显著降低,IL-6的含量升高。HLJDD组IFN-γ的水平趋于正常且IL-6的水平降低,抗炎细胞因子IL-4和IL-10均显著增加。

(2) 脑组织的代谢物紊乱

代谢紊乱可能影响AD病理的发生以及患者认知功能障碍。与WT小鼠相比,Tg小鼠大脑神经递质(NTs)无明显变化(靶向代谢组学),但瓜氨酸和蛋氨酸升高。HLJDD治疗后大脑中NTs水平显著增加,L-半胱氨酸减少(非靶向代谢组学)。

Tg小鼠脑中多不饱和脂肪酸(PUFA)与WT小鼠无显著差异,HLJDD治疗显著提高大脑中花生四烯酸(AA)、DHA、二十碳五烯酸(EPA)等,降低γ-亚麻酸(GLA)含量(图B)(靶向代谢组学)。

此外,HLJDD处理可抑制Tg小鼠大脑中的环氧合酶2(COX-2)和5-脂氧合酶(5-LOX)的表达(图C)。

OPLS-DA分析表明HLJDD给药能逆转Tg小鼠脑中脂质代谢发生失调,HLJDD组更接近WT小鼠(图D),共鉴定到40种病理脂质生物标志物(脂质组学)。Tg小鼠的17/21 PCs、5/5 PE、3/3葡糖神经酰胺(GlcCers),4/4神经酰胺(Cers)和5/7鞘磷脂(SMs)的水平低于WT小鼠。HLJDD增加小鼠脑中PC和PE来减轻该病变。

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3. 外周系统紊乱与药物作用

(1)外周血清的炎症因子表达变化

Tg小鼠血清IFN -γ、IL-13和IL - 12p70低于WT老鼠, 而单核细胞趋化蛋白1(MCP-1和IL-6升高,这与脑组织变化趋势一致。HLJDD可抑制Tg小鼠血清中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α的表达。

(2)外周血清的代谢物变化

与WT小鼠相比,Tg小鼠的外周Ω-6酸和Ω-9酸降低(图B)。HLJDD组血清PUFAs水平无变化。PUFA主要维持大脑的结构、功能和血管完整性。非必需脂肪酸在大脑中合成,但必需PUFA是由外周循环中获得。因此,将两者进行相关网络分析进一步确认HLJDD组脑组织PUFA是否来自外周循环(图 C),结果显示:血清PUFAs(DHA,EPA,LA和GLA)的含量与脑组织PUFAs负相关,血清AA水平与脑组织AAs正相关(靶向代谢组学)。

OPLS-DA证实Tg小鼠血清中脂质代谢发生失调,和脑中结果一致(图 D)。血清中筛选了13种脂质生物标志物,Tg小鼠这类标志物均降低,而HLJDD逆转了变化(脂质组学)。

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4. 肠道菌群的改变与药物作用

WT、Tg和HLJDD组菌群多样性无显著差异,但Tg小鼠的粪便菌群组成与WT组显著不同,HLJDD改善肠道菌群组成。

(1)门水平变化:

Tg小鼠的厚壁菌门(Firmicutes)种群数量比WT多,而拟杆菌门(Bacteroidetes)较低。

HLJDD后Firmicutes下降,变形菌门(Proteobacteria)增加。

(2)科水平变化:

Tg小鼠中Lachnospiraceae、Rikenellacae和Porphyromonadaceae相对丰度高于

WT小鼠,而Bacteroidales_S24-7_group、Coriobacteriaceae和Alcaligenaceae相对丰度较低(表4)。

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(3)属水平变化:

Tg小鼠Parassutterella、Blautia等相对丰度比WT小鼠低,而Bacteroides和Odoribacte等丰度较高。HLJDD治疗后增加Prevotellaceae_UCG_001, Lactobacillus, Helicobacter等,减少Bacteroides, Roseburia, Anaerotruncu等相对丰度。LEfSe用于鉴定特定的细菌表型改变,六组间共有44种细菌发生显著变化(表5)。

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5. 活性成分小檗碱(Ber)、黄连解毒汤方剂与西药多奈哌齐(Don)的作用比较

相较HLJDD,Ber在改善Tg小鼠认知缺陷方面略差。在作用机理上,Ber和HLJDD都表现在神经炎症、脂质代谢和肠道微生物群的调节作用,具体来说:

(1)神经炎症:HLJDD可上调多种神经递质,这与西药Don相似。Ber主要调控瓜氨酸、尿素和蛋氨酸,对中枢和外周炎症细胞因子的影响不如HLJDD,但显著增加大脑IL-13的水平。

(2)脂质代谢:Ber在调节中枢神经系统病理脂质方面与HLJDD相似,但对外周影响不如HLJDD。与HLJDD相比,Ber对DHA、EPA和OLA的调控作用较弱。

(3)肠道微生物群: Ber和HLJDD在调节肠道微生物群落的机制不同。与HLJDD相比,Ber对Prevotellaceae、Clostridiaceae、Bacteroidaceae等菌具有相反的调控作用 (表4、5)。

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主要结论

神经炎症与AD的发病密切相关,而脂质代谢紊乱和肠道菌群紊乱是潜在驱动因素。外周与中枢神经系统炎症和认知功能障碍相互影响,本研究通过靶器官和血清代谢组学、脂质组和微生物组学研究,推断炎症因子(IL-6和IFN-γ)、PCs和SCFA产生菌的结合是一种很有前途的AD早期诊断生物标志物,但需进一步验证。HLJDD抑制肠道失调和相关的Aβ积累,减缓神经炎症来逆转认知损伤。更重要的是,发现HLJDD的抗炎作用是通过脑肠轴的干预模式,为AD治疗开辟新的治疗途径,并通过中央-外周对比研究指导未来有效治疗方法的开发。

该研究的组别设计也非常值得参考:中药方剂组设置了高低2个浓度,同时设立了单味活性成分(小檗碱)及西药组(DON)。通过中药方剂组与单味活性成分组的结果比较,可进一步解释方剂中可能起到主要作用的活性组分;通过与西药组参比,可更为有力的说明中药的药效作用及突出中药多靶点的优势效应。