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中医药与肠道菌群 | 最新重磅GUT(IF=19):人参多糖增强PD-1抗体药物的肿瘤免疫治疗效果

2021-12-13
中科新生命
1926

编者按
肠道菌群是近年来中医药领域的研究热点,不仅与中医理论相契合,而且是中药口服发挥药效的重要靶点之一。基于肠道菌群的中药药理研究近年来也陆续刊登于核心期刊。
为了帮助广大研究者了解中医药相关肠道微生物的研究进展与方法,我们收集整理了近几年基于中药及肠靶轴研究的发表于GUT、Nature Communications、Theranostics等高水平期刊的论文。
【中医药与肠道菌群专辑】为大家精细解读重磅研究与进展。
【文献名称】Ginseng polysaccharides alter the gut microbiota and kynurenine/tryptophan ratio, potentiating the antitumour effect of antiprogrammed cell death 1/ programmed cell death ligand 1 (anti-PD-1/PD-L1)  immunotherapy
【杂志名】:GUT
【影响因子】:IF=19.819
【中药】:人参
【疾病】:非小细胞肺癌
【样本类型】:C57 BL / 6J小鼠负荷Lewis肺癌细胞(LLC)模型、临床患者
【技术方法】:靶向代谢组(SCFAs、氨基酸、脂肪酸);16S PicBio SMRT测序;转录组
【关键菌群】:Muribaculum,Bacteroides(B. vulgatus,P. distasonis)
【是否菌群验证】:是(粪便移植)
研究背景
【中药背景】人参作为药物或膳食补充剂在亚洲被广泛使用。长期服用人参提取物能调节大鼠肠道Bifidobacterium, Allobaculum, Lactobacillus, Clostridium等菌群丰度,人参提取物能增加粪肠球菌的丰度,提高肉豆蔻酸的含量进而达到抗肥胖的作用。人参含有许多活性成分,包括人参皂甙、精油、肽聚糖、多糖等。已有研究表明人参多糖(GPs)具有免疫调节功能,能激活巨噬细胞、T细胞和自然杀伤细胞。此外,GPs可以改善肠道代谢并调节肠道菌群,特别是增强代谢人参皂甙的细菌Lactobacillus spp.Bacteroides spp.的生长。
【疾病和肠道菌群】肺癌在全球有极高的发病率和死亡率,其中约80-85%是非小细胞肺癌(NSCLC)。程序性死亡1(PD-1)及其配体PD-L1的抑制药物,是缺乏EGFR或ALK突变的转移性NSCLC的有效疗法,但其缓解率(<25%)较低,甚至会导致过度进展性疾病(HPD),因此需要更有效的方法治疗大多数的晚期NSCLC患者。已有研究证实PD-1/PD-L1通路抑制剂与具有免疫调节作用的疗法或药物组合,可增强抗肿瘤反应。近期,肠道菌群引发了人们对癌症免疫疗法的关注:如Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium等,无论在临床前肿瘤模型还是癌症患者上,均表现出了对提高免疫治疗的良好反应。 因此,调节肠道微生物群的策略,被认为能够用于治疗癌症患者,并作为新的免疫治疗响应预测生物标志物。
在癌症免疫治疗中,人参多糖(GPs)的治疗潜力尚需探究,澳门科技大学等研究团队通过小鼠模型和临床样本分析发现:GPs与αPD-1单克隆抗体(mAb)具有协同抗肿瘤作用,或能通过调控肠道菌群组成及代谢物的方式调节免疫,进而增强对免疫治疗的应答。相关研究成果发表于顶级期刊《Gut》。
研究路线

主要研究结果
一、联合治疗对动物模型的抗肿瘤作用
研究者首先评价了C57 BL / 6J小鼠负荷Lewis肺癌细胞(LLC)模型的肿瘤生长和发展情况。肿瘤接种后0天给小鼠进行GPs灌胃,第9天进行αPD-1mAb注射(图A),以肿瘤体积和重量评估其抗肿瘤效果。GPs联合αPD-1mAb治疗显著降低了肿瘤进展,肿瘤生长受抑制,小鼠存活期延长(图B-D)。
同时,联合治疗在HuPD-1小鼠负荷LLC细胞(图E-F)和B16-F10荷瘤的小鼠模型中也有明显抗肿瘤作用效果。

二、联合治疗对免疫系统的作用
为了确定联合治疗对免疫系统的影响,作者分析了外周血、脾脏和肿瘤组织的免疫相关变化:
1. CD8+T 细胞:联合治疗组中,外周(血液和脾脏)和肿瘤组织中CD8+ / CD4+比率均增加(图A);CD8+ T细胞中功能性细胞因子IFN-γ,TNF-α和GZMB的产生也均增加(图B–D)。
2. 调节性T细胞(Tregs):Tregs是免疫抑制肿瘤微环境的主要参与者,通常与预后不良和生存率相关。联合治疗引发外周和肿瘤组织FoxP3+调节性T (Treg)细胞的减少(图E),这可能有助于预防HPD。

免疫组化分析在肿瘤组织中得到与上述一致的结果(图F–K)。以上结果表明,联合治疗可通过激活CD8+ T细胞并抑制Tregs的功能而发挥作用。

三、联合治疗对肠道微生态的影响
1. 肠道微生物结构变化
采用16S PicBio SMRT测序对粪便样本研究,与αPD-1单抗组相比,联合治疗后微生物组成发生变化,Muribaculum丰度明显增加(图A-B)。与模型组相比,GPs组的Muribaculaceae丰度增加,这表明GPs可能会影响Muribaculaceae丰度。

2. 抗生素处理:抗生素处理使得各组抗肿瘤效果没有差异(图C-D),说明上述效应依赖于肠道菌群。

3. 对肠道多种细胞群的影响:
a. 结肠中炎性细胞:减少结肠中炎性细胞的浸润(图E-F)。

b. 上皮内淋巴细胞(IELs):IELs在维持障碍功能和降低对感染和免疫病理学的易感性方面发挥着重要作用。研究者对小肠中IELs进行了转录组研究:与单独的αPD-1mAb组比,联合治疗组中的上皮保护基因、代谢相关基因和S100A6明显上调;相反,免疫球蛋白可变区重链基因、免疫球蛋白可变区轻链基因和免疫球蛋白kappa变量基因等下调(图G);GO分析显示,差异表达的基因主要与溶酶体、分泌颗粒和能量代谢有关,这些基因可以保护肠屏障的完整性(图H)。与GPs组比,联合治疗组的免疫应答相关基因上调(图I,J)。

c. RORγt+ Treg细胞:RORγt+ Treg细胞可被菌群刺激所诱导,RORγt+Treg/Th17细胞间比例可维持肠道动态平衡。联合治疗组使RORγt+ Treg细胞的比例增加,而Th17细胞比例降低(图K-L),说明其对肠道有保护作用。

四、联合治疗对菌群相关代谢物的影响
1. 短链脂肪酸
微生物可能通过短链脂肪酸(SCFAs)诱导RORγt+ Tregs产生进而达到抗肿瘤效果。SCFAs作为能量来源能阻止营养缺乏导致的肠上皮细胞和淋巴细胞自噬,还可进入血液,进而通过GPCR受体途径或抑制HDAC表观活性而影响其他的组织和细胞。SCFAs在菌群调控免疫治疗过程中具有重要作用。
该研究利用质谱法检测了血浆中SCFAs的水平。结果显示:αPD-1mAb处理后,除乙酸外,其他SCFAs丰度均增加。与单独使用αPD-1mAb的组比,联合治疗组中的戊酸丰度增加更显著(图A–G)。

2. 色氨酸代谢
作者进一步检测了氨基酸和脂肪酸代谢物的变化。与单独使用αPD-1mAb组比,联合治疗组中,色氨酸代谢在这些代谢产物中贡献最大,L-犬尿氨酸与犬尿氨酸/色氨酸(Kyn / Trp)的比率(表示为IDO活性)显著降低,但L-色氨酸没有显著变化。为了进一步研究IDO在肿瘤组织中的活性,通过免疫组化染色发现联合组IDO的表达水平下调(图K)。

为了确定GPs对肠道微生物中色氨酸代谢的影响,通过体外发酵对GPs进行人粪便样品的发酵。研究发现GPs在有氧和厌氧下均显著增加L-色氨酸的产生,并降低犬尿氨酸的产生,以及Kyn / Trp的比例,这表明GPs可能通过肠道微生物影响色氨酸代谢。
五、临床分析:免疫治疗响应 VS 非响应患者的肠道菌群差异
16例中国NSCLC患者接受抗PD-1阻断治疗,10例为有响应者(Rs),6例为无响应者(NRs)。为了研究肠道微生物组成是否与抗PD-1免疫疗法有关,对粪便样本进行16S PacBio SMRT测序。
响应者(Rs)的肠道微生物的丰富度和均匀度高于无响应者(NRs)(图A)。在物种水平上,Rs组拟杆菌的相对丰度居首位,其次是Parabacteroides distasonis 、bacterium LF-3Sutterella wadsworthensis HGA0223。并且这些细菌丰度在响应好、生存率更高的患者也是增加的(图B-E)。

六、粪便移植
将6位NRs的粪便转移到无菌小鼠中,菌群定植后进行LLC肿瘤细胞接种。然后,用上述相同的GPs方案进行治疗(图A):
1. 药效
如预期一致,小鼠对αPD-1mAb治疗具有抗性。但用GPs加αPD-1mAb联合治疗,显著减缓了肿瘤的生长(图B)。

2. 对免疫系统的影响
流式细胞和免疫组化分析提示血液和肿瘤中CD8+ / CD4+ T细胞的比例、CD8+T细胞中的IFN-γ、TNF-α和GZMB增加(C-F,H–M)。此外联合组Treg细胞更少,这与治疗功效的提高相关(图G)。

3. 对色氨酸代谢的影响
联合治疗后Kyn / Trp比值降低(图J),肿瘤组织中的IDO表达较低(图K-L)。

4. 对肠道菌群的影响
与αPD-1 mAb组和模型组比,联合治疗拟杆菌(Bacteroides)丰度显著增加,尤其是B. vulgatusP. distasonis(图M-O)。这些结果表明,联合处理可重塑肠道微生物群,从NRs向Rs转变,从而使αPD-1单抗治疗的反应敏感。


主要结论
以肺癌荷瘤小鼠为模型,人参多糖能增强抗PD-1单抗的抗肿瘤效果,伴随活化CD8+T细胞增加,调节性T细胞减少。抗肿瘤作用可能依赖于其对肠道菌群的影响,通过微生物组和菌群代谢组研究发现:肠道菌群组成和代谢物发生明显改变,包括戊酸增高、犬尿氨酸/色氨酸代谢变化等。联合治疗上调了上皮细胞相关保护基因的表达,同时短链脂肪酸和犬尿氨酸进一步进入血液循环,增强免疫功能,进而抑制肿瘤生长、延长生存期。
临床研究中进一步发现,抗PD-1治疗响应者的肠道菌群多样性更高,狄氏副拟杆菌和普通拟杆菌的丰度更高。接受非响应患者菌群的小鼠,其对抗PD-1治疗的敏感性,可通过人参多糖治疗予以恢复。
肿瘤免疫治疗响应与肠道菌群的关系被越来越多地证明和关注。免疫调控是中医药的优势功能, 该研究揭示了中药通过调控肠道菌群增强肿瘤免疫治疗的巨大应用潜力。