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项目文章:外泌体蛋白质组学解析哮喘进程新机制

2021-12-22
中科新生命
1420

编者按
气道上皮细胞(AECs)是抵御外源抗原的第一道防线,外源抗原通过分泌生物活性介质来影响肺部的微环境,有助于将树突状细胞(DCs)等免疫细胞募集到发炎区域,从而刺激过敏性炎症。细胞间通讯对哮喘发病机理至关重要,并且主要由可溶性介体介导。外泌体是细胞间通讯中的重要角色。然而,气道上皮细胞(AECs)产生的外泌体是否参与哮喘的发展尚不清楚。

2021年4月上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸科研究团队在Journal of Allergy and Clinical Immunology杂志(IF=10.228)上发表题目为“Epithelial exosomal contactin-1 promotes monocyte-derived dendritic cells-dominant T cell responses in asthma”的研究成果,利用lable-free蛋白质组学技术及分子生物学手段揭示了外泌体蛋白CNTN1介导的哮喘发病新机制,该研究为治疗过敏性气道炎症提供了新的策略。中科新生命提供了外泌体label-free蛋白质组学技术服务。


【研究材料】

屋尘螨(HDM)刺激原代气道上皮细胞(pAECs)产生的外泌体;对照选用PBS处理的pAECs产生的外泌体

【组学方法】

Label-free蛋白质组学技术
研究方法

    TEM和NTA分析AECs分泌的外泌体特征

    分析AECs分泌的外泌体是否参与哮喘的免疫应答

    探索AECs分泌的外泌体参与DCs促进哮喘的发展

    验证CNTN1介导过敏性气道炎症并探索CNTN1的依赖性信号通路分子免疫应答

    分析AECs分泌的外泌体是否参与哮喘的免疫应答

    队列验证:CNTN1可作为哮喘患者的潜在生物标志物免疫应答
研究结果
一、HDM处理引发AECs分泌外泌体

作者首先使用透射电子显微镜扫描(TEM)和NTA分析确定HDM处理前后,AECs均具有生成外泌体的能力:囊泡直径范围为30至150 nm,且CD63和CD81(外泌体相关标记)染色呈阳性。作者进一步比较了HDM暴露与未暴露的小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中的外泌体。

结果表明, HDM处理的小鼠的BALF中,外泌体的数量增加,CD63和CD81的表达也明显高于对照组。上述结果表明,上皮细胞在正常生理状态下具有产生外泌体的能力,而在HDM刺激后将释放出更多的外泌体。

图1 气道上皮细胞来源的外泌体促进HDM诱导的过敏性哮喘

二、AECs分泌的外泌体参与HDM诱导的过敏性哮喘

为了确定AECs分泌的外泌体是否参与哮喘的免疫应答过程,作者先用磷脂酶抑制剂GW4869来阻断外泌体合成与释放,发现抑制外泌体分泌可以显著缓解哮喘症状(炎症反应降低);之后用HDM-AECs EXO处理小鼠,发现外源HDM-AECs-EXO可以诱导并显著增强了2/17型免疫反应,导致肺中嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞过多。这说明源自AECs分泌的外泌体参与了HDM 诱发的哮喘反应。

三、AEC衍生的外泌体促进DCs的募集,增殖和活化

为了确定AECs来源的外泌体影响的细胞类型,作者在气管中施用了HDM-AECs-EXO。之后通过流式细胞术(FCM)测定肺细胞谱,发现DCs(树突状细胞)的百分比高于其它细胞。之后作者将PKH26标记的HDM-AECs-EXO施用于小鼠的肺部,发现50%的标记外泌体被肺DCs摄取。

作者进一步证实HDM-AECs-EXO处理会激活DCs的功能。这些结果表明,HDM-AECs-EXO暴露可促进DCs的募集,增殖和活化。作者用HDM-AECs-EXO刺激的DCs在敏化期移植到小鼠中,发现EXO-DCs促进过敏性气道炎症发生(处理后小鼠BALF细胞增多,嗜酸性细胞,血清炎症因子升高,支气管周炎症加重)。


图2 上皮细胞衍生的外泌体处理后肺中DCs积累

四、HDM-pAECs-EXO包含CNTN1蛋白

为确定外泌体中影响哮喘进程的关键成分,作者对PBS处理的pAECs(PBS-pAECs-EXO)和HDM处理的pAEC(HDM-pAECs-EXO)上清中的外泌体进行了Label Free蛋白质组学分析,分别鉴定到486和445个蛋白,27种蛋白在两组间差异较大。

随后作者发现在用HDM处理的pAECs或BEAS-2B细胞以及细胞上清外泌体中,CNTN1的表达均增加,免疫组化(IHC)和免疫荧光(IF)检测观察到HDM处理的小鼠肺组织中CNTN1同样增加。这暗示外泌体中的CNTN1可能是介导变应性哮喘中促炎作用的效应因子。


图3 HDM引发外泌体中的CNTN1蛋白含量增加

五、AECs-EXO中CNTN1蛋白促进过敏性气道炎症机制研究

通过腹腔注射CNTN1蛋白,作者发现CNTN1能够促进DCs在肺内的招募、分化和迁移。之后作者将HDM处理的BMDCs(联合或不联合CNTN1)通过鼻内移植WT小鼠。结果发现,HDM与CNTN1联合引发的BMDCs处理的小鼠肺炎性细胞因子水平升高,支气管周炎症增强,粘液产生增加。这些数据证实CNTN1引发的DCs促进哮喘的发展。

作者进一步发现在CNTN1暴露后,BMDCs中在mRNA和蛋白水平上Notch2的表达增加,Co-IP证实CNTN1和Notch2存在相互作用。作者使用Notch途径的阻断剂GSI,发现GSI可以逆转CNTN1诱导的过敏性炎症。这些结果证明CNTN1以Notch2信号传导依赖性方式诱导DCs活化,从而促进了过敏性气道炎症。


图4 CNTN1以Notch信号依赖方式诱导DCs激活,进而促进哮喘的发展

六、CNTN1可能作为哮喘患者的潜在生物标志物

接下来,作者使用健康对照者,哮喘患者(对HDM敏感)和ABPA哮喘患者的血液样本进行了队列研究。与健康对照组相比,哮喘或ABPA患者的血清IgE水平升高,对HDM过敏的哮喘患者的无外泌体血清和含外泌体血清中的CNTN1水平显著增加;数据分析发现哮喘患者的血清CNTN1浓度与IgE,呼气一氧化氮(FeNO)和鼻呼气一氧化氮(FnNO)呈正相关。这些发现表明CNTN1可作为哮喘患者的候选生物标志物。


图5 哮喘患者的CNTN1水平与气道炎症反应相关
总结
本研究首次揭示了AECs的外泌体在调节DCs引发的过敏反应中起关键作用,发现并证实AECs中的CNTN1蛋白通过Notch2信号通路诱导DCs活化,从而促进了哮喘进程。此外,哮喘患者的队列研究表明CNTN1可作为潜在的生物标志物。本研究揭示了外泌体在哮喘发病机制中的重要作用,也为过敏性气道炎症的临床治疗提供了新的策略。