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STTT(IF 38.104) 协和医学院杨俊涛教授团队发布恒河猴感染COVID-19的分子机制及潜在治疗药物

2022-08-12
中科新生命
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临床组织是分子机制研究的首选样本,但COVID-19临床组织很少,且大多来自终末期患者的尸检。动物模型,尤其是非人灵长类动物模型的建立,可为COVID-19相关研究奠定基础。

20221月北京协和医学院杨俊涛教授Signal transduction and targeted therapyIF 18.187杂志上发表题目为Proteomic and phosphoproteomic profiling of COVID-19-associated lung and liver injury: a report based on rhesus macaques的研究成果,利用蛋白组学磷酸化蛋白组学首次对感染SARS-CoV-2的恒河猴早期肺组织和肝组织分子变化进行研究,为进一步研究SARS-CoV-2的分子机制和药物发现提供了有效的数据资源。

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研究材料:

空白对照组和病毒感染组;SARS-CoV-2感染7天后的恒河猴肺、肝组织(n=8

 

技术路线:

步骤1:肺、肝损伤表型分析

步骤2:蛋白组学分析

步骤3:差异蛋白PPI互作

步骤4:磷酸化蛋白组学分析

步骤5:激酶预测

步骤6:激酶与药物整合预测

 

研究结果:

1. 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝损伤检测

采用定量RT-PCR方法检测感染恒河猴鼻、喉、肛门拭子中SARS-CoV-2 RNA含量,确定7天后SARS-CoV-2 病毒含量趋于稳定(图1a)。从胸片可直观看到,病毒感染组恒河猴肺部间质滤过和渗出性病变(图1b)。与对照组相比,感染组恒河猴肺部有多个病理病变和出血点(图1c)。进一步定量RT-PCR检测发现,感染组恒河猴肝脏中的病毒载量低于肺部(图1d)。从病理切片可以看到感染组恒河猴肺部有明显的炎性细胞浸润,肺间隔局部增厚,血管血栓形成;肝脏中肝窦间隙增宽、炎症细胞散在浸润(图1e)。

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图1 恒河猴SARS-CoV-2感染及随后肺、肝损伤的验证


2.恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝组织蛋白组学分析

蛋白质组学定量了肺中6715个蛋白和肝脏中5238个蛋白。主成分分析(PCA)结果显示,对照组和病毒感染组之间肝脏蛋白表达谱的总体差异大于肺(图2bc)。与对照组相比,感染组肺组织和肝组织差异表达蛋白分别为757个和1219个(图2d)。KEGG通路富集分析显示,在感染组的肺组织中,核糖体、DNA复制、RIG- I样受体或信号通路、错配修复等相关通路蛋白上调;与ECM -受体相互作用关系最为密切蛋白的下调(图2e)。在感染组的肝脏组织中,核糖体、氨基酰基-tRNA生物合成、氧化磷酸化等相关通路蛋白上调;剪接体、调控肌动蛋白细胞骨架和局部粘附等相关蛋白下调(图2f)。

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2 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝组织蛋白比较


3.差异蛋白PPI互作分析

将通路富集到的蛋白进行蛋白相互作用(PPI)分析。肺部(图3a)和肝脏(图3b)在感染后均出现代谢相关蛋白和核糖体相关蛋白水平升高。结合KEGGSTRING数据库,发现感染组肺组织RIG-I通路、蛋白加工、DNA复制和修复相关蛋白上调,肝组织氧化呼吸链和蛋白质加工通路相关蛋白发生显著变化。蛋白酶介导的蛋白质降解在肺中活跃,但在肝脏中受到抑制(图3cd)。同时发现,SARS-CoV-2感染7天后,局灶性粘连周围蛋白呈下降趋势。整合素α家族中的ITGA5和链接ECM和细胞骨架的DAG1在感染肺和肝脏组织中均下降(图3cd)。

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3 差异蛋白互作分析


4. 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝组织磷酸化蛋白组学分析

磷酸化是细胞对刺激做出反应的一种快速调节方法,已在一些SARS-CoV-2感染的细胞模型或尸检样本中检测到。因此,作者分析了恒河猴肺和肝脏的磷酸化蛋白质组,以期找到SARS-CoV-2感染期间的潜在药物靶点。共定量了肺中4185个蛋白质的12,418个磷酸位点和肝脏中3191个蛋白质的8134个磷酸化位点。其中,肺部873个蛋白质的1162个位点和肝脏712个蛋白质中的960个位点差异表达。通路富集和PPI互作分析发现,肺中上调的磷酸化蛋白富集于代谢、剪接体和泛素介导的蛋白水解等途径,而下调磷酸化蛋白与Fc-γ-R介导的吞噬、粘附连接和基础转录因子相关(图4a)。在肝脏中,上调的磷酸化蛋白富集于多种代谢途径,而下调的磷酸化蛋白与基础转录因子、剪接体、RNA转运等相关(图4bPPI互作结果显示,上调的磷酸化蛋白多于下调的磷酸化蛋白(图4cd)。

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图4恒河猴肺、肝中差异磷酸化蛋白KEGG通路富集和PPI分析


5. 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝组织激酶预测

为获得更多信息,将恒河猴肺和肝组织磷酸化位点进行激酶预测。在肺中,与炎症(PKRIKKβP38δJNK3)、细胞周期(CDK1CDK2)、增殖(MAP2K1MAP2K2)和代谢(AKT3PKCiAMPKs)相关的激酶被激活,而细胞骨架重组相关激酶MRCKα被抑制(图5a)。在肝脏中,代谢相关的激酶(AMPKsPKCs)被激活,而炎症相关的激酶(JNK1JNK2)则处于静止甚至抑制状态(图5b)。在蛋白组和磷酸化蛋白组数据中并没有发现所有的预测激酶(图5cd),说明激酶预测分析能扩大SARS-CoV-2作用靶点的探索范围。

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5恒河猴肺和肝中的激酶分析


6. 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝组织激酶与药物整合分析

DrugBank数据库中的药物与激酶预测结果进行整合分析, 发现11FDA批准的药物可能对预测的激酶有效,其中福坦替尼(Fostamatinib)、米诺环素(minocycline)和他莫西芬(tamoxifen)在肺和肝脏中可能都起作用(图6)。

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图6药物与恒河猴肺和肝中的激酶桑基图


小结:

与人类的尸检样本相比,恒河猴模型能够提供一个在感染早期研究组织分子变化的机会。研究人员首次对恒河猴SARS-CoV-2感染的肺和肝组织进行了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析,发现在受感染的肺和肝脏中,蛋白质合成和加工均激活,ECM、细胞间连接和细胞骨架均失调,但肺和肝脏都没有纤维化。并且发现,肺部在感染期间炎症反应增强,而肝脏在感染期间氧化磷酸化和代谢过程增强。该研究为进一步探索SARS-CoV-2的机制和药物发现提供了有效的数据来源。