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JCI insight 西南医院采用蛋白代谢多组学揭示SEMA7AR148W突变促进NAFLD疾病发展的分子机制

2022-10-28
中科新生命
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非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 是一种常见的健康问题,其患病率在全球范围内迅速增加。众所周知,包括遗传和环境因素在内的多种因素会导致 NAFLD 的发展。信号素是细胞外信号蛋白,信号素 7A (SEMA7A)是一种糖基磷脂酰肌醇锚定膜蛋白;初步研究表征了SEMA7A 突变的小鼠的肝细胞出现水肿和脂肪变性,推测 SEMA7A 突变可能导致脂质代谢紊乱和 NAFLD 发展。

 

2022年8月,陆军军医大学第一附属医院(又名西南医院)柴进课题组在JCI insight (IF 9.484)上发表题为“SEMA7AR148W mutation promotes lipid accumulation and NAFLD progression via increased localization on the hepatocyte surface”的研究文章。本项目利用蛋白质组学和靶向代谢组学技术研究了Sema7aR145W 突变(相当于人类 SEMA7AR148W)造成小鼠肝脏的脂质沉积的分子机制,表明SEMA7AR148W 突变是 NAFLD 的重要的遗传决定因素,并通过增强蛋白激酶 C(PKC-α)信号传导引起小鼠肝内脂滴积聚。针对肝脏 中PKC-α 信号的靶向抑制,有望成为新的 NAFLD 疗法。中科新生命为其提供了TMT蛋白组学,脂质组学,靶向代谢组(中长链脂肪酸)检测的技术服务

 

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 研究材料

NAFLD患者活检肝脏样本;野生型(WT),Sema7aR145W杂合子和纯合子小鼠肝脏

 

 

 

 

 技术路线

步骤1:肝脏活检分析SEMA7A 杂合子突变与NAFLD严重程度相关;

步骤2:通过Sema7aR145W突变小鼠,进一步研究 SEMA7A 突变在 NAFLD中的作用;

步骤3:中长链脂肪酸检测发现纯合突变小鼠肝脏中FA和TG增加;

步骤4:蛋白质组学、qPCR和WB发现Sema7aR145W调控脂质合成关键基因与激酶;

步骤5:qPCR 和蛋白质印迹分析表明Sema7aR145W突变增加其在膜上表达,并激活肝细胞中的PKC-α信号传导。

 

 

 

 

 研究结果

1. SEMA7A 杂合突变与NAFLD严重程度显著相关

为了探究SEMA7A 突变是否是NAFLD的潜在危险因素,研究人员分析了470 名 NAFLD患者,找出17名具有SEMA7A杂合突变的肝脏样本及13名配对的对照肝脏样本。肝脏组织学分析显示,具有 SEMA7A 杂合突变的 NAFLD 患者的脂肪变性和 NAS 的严重程度显著高于其匹配的对照组。

 

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图1 伴或不伴 SEMA7A 杂合突变的配对 NAFLD 患者的基线特征

 

 

2. Sema7aR145W杂合突变小鼠的NAFLD严重程度和肝功能水平显著升高

为了进一步研究SEMA7A 突变在 NAFLD 进展中的功能作用,构建了Sema7aR145W(相当于人类 SEMA7AR148W)杂合子小鼠。在用高脂饮食 (HFD) 喂养 26 周后,我们发现杂合子小鼠的体重,肝脏重量和肝脏/体重比均显著高于对照组。组织学评估显示Sema7aR145W杂合子小鼠中的肝脂滴和NASs也显著增加。与对照组相比,肝脏TG,总胆固醇(Tch)以及血清ALT和AST的水平显著增加。因此,Sema7aR145W杂合子突变促进了小鼠NAFLD的进展


 

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图2 Sema7aR145W杂合子突变促进HFD喂养后小鼠NAFLD的进展

 

 

3.  Sema7aR145W突变可增强小鼠肝脏中的FA和TG合成以及FA摄取

收集10 周龄的雄性 WT 和 Sema7aR145W 纯合子小鼠(每组 n = 4)的肝脏样本,通过中长链脂肪酸的靶向代谢组学和定量脂质组学分析表明,与对照组相比,Sema7aR145W纯合突变显著增加了小鼠肝脏 FA 和 TG聚积。

 

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图3 靶向代谢组和脂质组学数据分析

 

接下来,标记定量蛋白质组学分析显示,在 5874 个定量蛋白质中,232 个蛋白被上调,260 个蛋白被下调。通过实时定量PCR (qPCR) 和蛋白质印迹分析表明,Sema7aR145W纯合突变上调了FA 和 TG 合成的关键基因(Acaca/Acc1、Fasn、Scd1、Gpat 和 Lipin2)、FA摄取基因(Cd36、Fatp5 和 Caveolin1)和 FA 分解代谢基因(Plin3、Plin5 和 Cpt1β)。这些数据表明 Sema7aR145W突变增强了小鼠肝脏 FA 和 TG 合成以及 FA 摄取。

 

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图4 蛋白质组学鉴定结果、火山图和KEGG通路注释

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图5 Sema7aR145W突变增加了小鼠肝脏中的FA和TG合成以及FA摄取

 

4. Sema7aR145W突变通过增强 PKC-α 信号传导,促进转录因子 Srebp1 和 Chrebp 以及核受体 Lxr 的表达,增强肝脏 FA 和 TG 合成和 FA 摄取

研究人员调研发现PKC-α 信号传导介导糖尿病大鼠的脂质代谢。通过蛋白表达分析,发现核受体Srebp1、Chrebp、Lxr及其靶基因 Acc1、Fasn、Scd1、Cd36 的表达和PKC-α 磷酸化水平,在 Sema7aR145W纯合子的肝脏和原代肝细胞中显著增加。这些发现表明,Sema7aR145W突变通过增加小鼠肝细胞中 PKC-α磷酸化,增强核 Srebp1、Chrebp 和 Lxr 表达,从而促进FA 和 TG 合成和 FA 摄取。

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图6 关键因子的蛋白表达的相对水平的蛋白质印迹分析

 

5. Sema7aR145W突变增加其在细胞膜上表达,并激活肝细胞中的PKC-α信号传导

免疫荧光和免疫组织化学表明 Sema7aR145W纯合突变显著增加了肝细胞膜上的Sema7a蛋白。对小鼠原代肝细胞的膜蛋白进行检测显示,Sema7aR145W 纯合突变增加了膜上Sema7a 与其受体集成素 β1 蛋白结合,但与另一种 Sema7a 受体 plexin C1无关。通过抑制集成素 β1的表达,可显著降低 Sema7aR145W纯合小鼠原代肝细胞中 PKC-α 磷酸化水平以及 Sema7a 和 PKC-α 之间的相互作用,表明 Sema7aR145W突变通过其受体集成素 β1激活PKC-α信号通路。

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图7 免疫荧光、免疫组化、免疫共沉淀分析结果

 

 

 小结

综上所述,本文揭示了SEMA7AR148W突变导致脂质在肝细胞中积累的潜在机制。首先,SEMA7AR148W突变增加膜上的Sema7a蛋白,并与其受体集成素β1蛋白结合,增强肝细胞中的PKC-α磷酸化水平。其次,激活的PKC-α信号可增强转录因子SREBP1和ChREBP以及核受体LXR的表达,促进肝细胞中的FA和TG合成以及FA摄取,引起肝脏中脂滴的积累,导致NAFLD的发展。

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