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【老司机切磋】蛋白质组学与验证,您所关心的问题都在这里

2017-09-15
中科新生命
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作为国内最早从事蛋白质(组)学研究,以及最早对外开展蛋白质(组)分析服务的老司机,中科新生命积累了超过10年的相关经验。在这十多年间,经历了蛋白质(组)学技术飞速发展和普及的历程,从2D凝胶电泳到TMT,从WB到MRM再到PRM,从单蛋白鉴定到组学再到修饰组等;也目睹了不断以我们的数据实现公开发表,甚至登上顶级期刊的荣誉殿堂,例如从经典的《Molecular & Cellular Proteomics》到今年的《Science》等。我们希望能够更多地分享一些自己的经验,为各位老师的蛋白质组学研究之路提供有益的帮助。

今天就与大家来聊一聊蛋白质组与后续验证的那些事~请看以下对话!


why选择这个话题来聊?

因为蛋白质组分析,是一个大规模数据采集的过程,其中不可避免地出现不准确、不真实的数据。从功利的角度来说,是否对蛋白质组学结果进行了验证,是蛋白质组学数据能否过审稿人法眼的重要因素之一。最近我们遇到了很多的老师在这个问题上栽跟头,所以觉得有必要跟大家探讨一下。

蛋白质组学结果究竟需不需要验证?

如上所述,如果要保证蛋白质组学结果与结论的准确性,非常有必要进行验证。通常实际情况中,碰到最多的问题是:“如果蛋白质组数据,没有进行验证,到底影响不影响发文章?”

在蛋白质组研究模式刚兴起的那段幸福时光中,很少有发表的文章进行验证,即使是业内头牌《Molecular & Cellular Proteomics》。但是幸福的时光总是短暂的,随着蛋白质组学研究的逐渐兴起,以及靶向分析技术的发展进步与普及,相关的要求也越来越高,直到去年的这个时候,如果有老师问我们这个问题的时候,我们的回答通常也是:“如果有验证最好,能投个影响因子高点的杂志”。但是,如果现在有老师问我们这个问题,我会毫不犹豫的说:“如果不验证,那就是给自己挖坑”。也就是说,从蛋白质组文章发表的要求来看,验证已经从早年间的“奢侈品”到前些年的“高配”,到目前的“标配”。

为什么说现在做蛋白质组不验证就是给自己挖坑,有什么悲剧可以拿出来给大家高兴高兴吗(开个玩笑,有此经历的老师别介意)?

最近我们遇到很多老师投稿时遇到的问题,就是审稿人要求对蛋白组数据进行验证,然后要求补实验。通常遇到这种补实验的项目,我已产生一丝悲观(抱歉,我本身是一个悲观主义者),很多时候最终结果也验证了我的悲观。

大多数情况下,蛋白质组要回头补实验,真心是个坑。为什么这么说?因为蛋白质组本身不可避免存在一定几率的不准确和错误率,所以通常情况下选择感兴趣的目标蛋白,再利用更特异性的方法(如WB、MRM等)进行验证时,有可能验证结果是:表达水平与蛋白质组结果并不一致。反过来说,如果都是一致的,那就没必要验证了。所以蛋白质组学结果验证,是一个去伪存真的过程,如果有不一致的结果并不是说蛋白质组做的就有问题(前提是蛋白质组实验过程有严格质控)。

大家可以想象一下,如果我没有做验证,然后把蛋白质组的结果送给审稿人评审,告诉审稿人和读者,我在蛋白质组结果中发现某些蛋白表达有差异,这个蛋白功能如何如何重要,与某个生物过程如何如何相关。如果我是审稿人,我也会问,这些蛋白的表达确实变化了吗?去做个验证的补充实验吧。如果补充验证的结果与蛋白组结果一致,那就恭喜了。但是如上所述,存在一定的风险是(从经验来说,风险还是比较高的):验证结果与蛋白质组并不一致。So,怎么跟审稿人交差呢?这是个无法填的坑。这个坑的形成有很多因素,包括因为蛋白质组是个大规模分析,并且大家常用的扫描方式是DDA(感兴趣的老师可以去查查什么是DDA,什么是DIA),在这种扫描方式下,存在较大的数据采集的随机性。另外,还需要考虑不同批样本的生物学差异,不同批次进行的样本制备、酶解过程等都会存在或多或少的差异。如果恰巧你选择的蛋白属于丰度比较低的一类蛋白(很多老师偏向选丰度低的,因为这一类通常是功能比较重要的细胞因子或信号分子等),该风险的指数就更大了。无论是哪种分析方法,物质丰度越低、准确度就越低。

那么蛋白质组学验证正确的打开方式是什么?

依我个人的见解,蛋白质组的研究过程应该是:

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如果跳过验证这一步,不但给文章发表挖坑,也给后续的研究挖坑。至于大家比较头疼的,挑选哪些差异表达蛋白进行验证,可以借鉴我们昨天发的攻略:终于找到你 | 挑选差异蛋白攻略大全 以及与差异蛋白相关的2篇内容:【老生常谈】P值是如何来的! 

【REVIEW】你从哪里来,差异蛋白!

如你所述,验证似乎真的很重要,但问题是有很多我们感兴趣的物种和蛋白,很难获得抗体去做验证啊?

首先,我们并不建议用PCR来验证。虽然PCR几乎没什么技术限制,但是PCR反映的是mRNA水平的变化,转录水平的变化与蛋白水平并不一定是一致的,所以用PCR验证的说服力相对较低。

如果是用抗体验证,的确是个常规和公认的思路。虽然,目前也有一些对于抗体质疑的声音,(感兴趣的老师可以看看:【深度】科研抗体的水究竟有多深?起底抗体产业最大隐忧 以及我们转过的一篇:【报道】自由放任埋下的抗体“祸根”,但我个人认为抗体目前还是公认的金标准,抗体验证仍然是首选之一。当然,WB这类实验的通量比较低,多个候选一个个WB做过来,也是很要命的事,而且购买抗体的成本也不低。但是,对于个性化定制的抗体,大家还是要谨慎为好。毕竟目前定制抗体的成功率、质量、周期还是有较高风险的,包括价格也很贵。除此之外,还可以考虑采用的方法就是质谱法,包括经典的MRM/SRM和PRM方法,也是目前比较公认的验证方法。

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提到SRM和PRM,貌似最近非常热,这种方法到底有多靠谱?既然也是个质谱方法,是否真的适用于蛋白质组验证呢?

关于SRM/PRM方法相关的介绍,大家可以看我们之前写过的一篇软文:新神器来袭:PRM技术——蛋白质组学验证,无缝对接!!这里就不再详细啰嗦了,小结一下:

  1. 从技术原理本身来说,该方法具备超过抗体方法的专属性、选择性;

  2. 已应用于临检,所以绝对靠谱;

  3. 已经有大量的文献应用,包括独立用MRM或PRM进行目标蛋白、修饰位点的定量,也包括用于蛋白质组、磷酸化蛋白质组、乙酰化蛋白质组的验证,文章档次覆盖《Nature》、《Cell》、《PNAS》等(如需原文,请发邮件至liwenjing@sibs.ac.cn索取)。

除了进行蛋白定量,SRM/MRM和PRM还可以对目标修饰位点进行定量和验证,这点是目前极少数抗体能够实现的,可以说是修饰蛋白质组验证的神器(APT后续会推出相关产品,敬请期待)。其中PRM可以认为是MRM的升级方法,其基于高分辨平台,实现更高的特异性和灵敏度,以及具备定性能力和更容易的方法开发。

另外,最近还发现了一个不得了的事,跟大家分享一下。(重点来了!敲黑板)

大家可以看这篇《Molecular & Cellular Proteomics》上的社论:Western Blots versus Selected Reaction Monitoring Assays: Time to Turn the Tables? 2013 Sep;12(9):2381-2. doi: 10.1074/mcp.E113.031658. 这篇社论主要探讨的就是蛋白质组的验证问题,以及WB和SRM/MRM哪个更好:

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当然,我个人观点仍是WB验证仍是主流方法,短时间内不会有改变,所以哪个更好不是我关注的问题。我所关注的问题是这个社论的作者:Ruedi AebersoldAlma L. Burlingame and Ralph A. Bradshaw

做蛋白质组研究的老师,对Ruedi Aebersold不会陌生,此人是该领域的顶级大神之一(另外一位是Matthias Mann大神:label free分级技术就是参考此大神的方法),Ruedi Aebersold也是《Molecular & Cellular Proteomics》的编委。另外两位,可能大家相对陌生,我们来八卦一下,大家看看这个:

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这两位可是蛋白组标杆杂志《Molecular & Cellular Proteomics》的正副主编大人。也就是说,作为蛋白组标杆杂志主编和大神是极力推荐大家用SRM/MRM等质谱法进行蛋白质组验证的。而且,从实际投稿遇到的情况来看,的确很多审稿人直接会推荐采用质谱法来填坑。

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今天的分享到此告一段落,总结以下:

  1. 从目前的蛋白质组发展和对文章发表的要求来看,建议大家做完蛋白质组就要做验证,最好不要抱侥幸心理。如果是审稿人让你补验证,那就是天坑。

  2. 验证的方法,推荐抗体法,抗体最好是大公司的商业化抗体;或者采用SRM/MRM或PRM质谱法(更推荐PRM法),同样很靠谱、应用很广。


让我们一起拒绝挖坑(我们也不想再一个一个地被动填坑),挽救即将入坑小伙伴!

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APT之前也推出过定量蛋白质组-PRM验证一站式打包服务,具体请看:【新品推介】一站式打包服务,中科PRM为您减压

现今为了推动蛋白质组验证的研究模式,我们计划在开学季,重磅推出定量蛋白质组+PRM验证项目的促销活动,促销力度十分惊人!我们希望通过此活动的推广,有更多的老师在进行蛋白质组研究时,能够逐步形成组学筛选+验证的研究习惯,为文章发表和后续深入研究打下坚实基础。活动详情将会下周公布,敬请期待!