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当PRM遇到了 “血管清道夫”—— 研究多种HDL

2017-06-28
中科新生命
3667

Multiple apolipoprotein kinetics measured in human HDL by highresolution/accurate mass parallel reaction monitoring

利用高分辨精准靶向蛋白质组学技术PRM对多种人高密度脂蛋白进行蛋白动力学检测

Journal of Lipid Research  IF=4.8


研究背景

 在心血管系统中,低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)经常上演猫和老鼠的游戏。LDL携带胆固醇积存在动脉壁上,久了容易引起动脉硬化。而HDL则运载组织中的胆固醇,再转化为胆汁酸或直接通过胆汁从肠道排出。所以高密度脂蛋白是一种抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白,是冠心病的保护因子。因此HDL通常俗称“血管清道夫”。 然鹅,这样天使般勤劳可爱维护心血管健康的HDL,平时行事却非常低调(表达丰度低),因而增加了其研究的难度。但是,已经给大家安利过很多次的靶向蛋白质检测技术--平行反应监测(parallel reaction monitoring, PRM),因其高分辨率、高精确性以及优秀的抗背景干扰能力,为HDL动力学研究带来了契机。


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实验材料

经过一系列生理指标和遗传指标筛选出的三名志愿者连续32天摄入富含不饱和脂肪的饮食。在第28天早上,三名志愿者静脉注射稳定同位素标记的D3亮氨酸(D3-Leu)。


实验流程

注射后不同时间点分别采集血样→制备血浆→富集HDL蛋白→ND-PAGE凝胶分离→胶内酶解→targeted LC/MS (PRM)相对/绝对定量。具体实验流程示意图如下:


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图1. 实验流程示意图


实验结果

1. 本研究旨在建立HDL综合动力模型,揭示每一种载脂蛋白的来源和去路代谢途径。最终模型与富集曲线和志愿者pool sizes契合度极高。

2. 三名志愿者中共鉴定到58种HDL蛋白。不同分子量分布的HDL,在样本中呈现较好的聚类情况。根据其聚类分布,主要分为5组(图2);第一组有22种蛋白,以alpha0 size为主;第二组含11种蛋白,以alpha1 和alpha2 size的HDL蛋白为主;三四五组分别主要包含8种、14种和2种HDL蛋白。

3. 三名志愿者中富集到的总apoA-Ⅰ(HDL蛋白的初级结构)pool分别为4923, 3524 和 3640 mg,这与肥胖超重的低HDL人群预期值相符。

4. 与SRM或MRM相比,PRM技术显著提高了分辨率和定量准确性(图3)。

5. 本研究中合成了FLEX标记的apoA-Ⅰ全长,并建立了PRM条件下该蛋白的内源亮氨酸(D0-Leu)和同位素标记亮氨酸(D3-Leu)的肽段检测质谱条件。PRM绝对定量结果如图4所示。

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图2. 不同HDL蛋白在样本中的层次聚类图


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图3. 文中PRM参数设置及其技术优越性描述


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图4. HDL载脂蛋白绝对定量结果


6. 建立了HDL各馏分SAAM Ⅱ体内代谢动力模型(图5示例图展示其中APOA2的Source和Removal pathway)。

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图5. APOA2代谢动力模型示例图


小编心得

本篇文献是利用PRM蛋白质靶向技术,对低丰度表达的HDL各个馏分进行绝对定量分析,发表在J Lipid Res上的方法性研究论文。文中探索了应用PRM技术对低丰度肽段检测和定量的参数,对于质谱方法学研究起到了很大的推动作用。同时建立了HDL载脂蛋白代谢动力学模型,为心血管疾病的研究夯实了基础。


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