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项目文章Pharmacol Res(IF 10)中山大学附属第三医院利用转录组和蛋白组分析揭示MUP1减轻内质网应激的关键作用

2022-12-15
中科新生命
2085

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非酒精性脂肪肝(NAFLD)以肝脏内甘油三酯的过度积聚为特征,与代谢紊乱密切相关。肝脏负责丰富的蛋白质合成和代谢稳态的协调。在疾病条件下,超负荷的蛋白质合成超过内质网(ER)的储存能力,损害其在肝细胞中的功能完整性,这可能会促进内质网应激。此外,受损的胰岛素信号传导导致葡萄糖/脂质储存和处置的失衡,引发一系列细胞内应激信号以响应代谢紊乱,在NAFLD的病理生理学中发挥重要作用。然而,在各种研究中,NAFLD中肝脏内质网应激是增强还是抑制仍存在争议。此外,关于ER应激反应受损如何影响代谢以及哪些ER应激反应分子参与了这一过程,目前还知之甚少。中山大学附属第三医院陈燕铭/石国军教授团队在PHARMACOL RES发表题为"Secreted MUP1 that reduced under ER stress attenuates ER stress induced insulin resistance through suppressing protein synthesis in hepatocytes"的研究论文,该研究利用转录组和蛋白组数据分析揭示了MUP1减轻肝脏内质网应激的关键作用,重组MUP1或其潜在衍生物可能是缓解NAFLD的一个有效的治疗靶点。其中,中科新生命提供了转录组蛋白组的检测和技术支持服务。

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 研究材料

小鼠肝脏组织、血清、尿液、小鼠原代肝细胞、AML12细胞、HepG2细胞

 

 

 技术路线

步骤1:在NAFLD小鼠模型中,肝组织中MUP蛋白显著减少;

步骤2:在内质网应激下,肝细胞中MUP1蛋白表达和分泌减少;

步骤3:MUP1刺激肝细胞中的内质网钙流出并诱导急性内质网应激反应;

步骤4:MUP1干预能够引起肝细胞预适应于内质网应激,进而缓解药物引起的内质网应激及内质网应激引起的胰岛素抵抗。

 

 

 研究结果

1.  NAFLD小鼠肝脏中MUP蛋白减少

生理指标检测结果发现NAFLD小鼠表现出体重过度增加、肝脏与体重和脂肪与体重的比率增加,以及肝脏甘油三酯含量显著增加。为了进一步探讨NAFLD小鼠肝脏内蛋白质的变化,作者采用了蛋白质组学分析,结果显示NAFLD小鼠的多种MUP亚型的显著下降,其中MUP1亚型可能对代谢贡献最大。这些数据表明MUPs,尤其是MUP1,可能是参与NAFLD代谢调节的重要因子

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图1 NAFLD小鼠生理指标及蛋白组检测

 

2. NAFLD小鼠肝脏内质网应激反应受损

KEGG分析显示,“内质网中的蛋白质加工”途径显著丰富。NAFLD小鼠中,未折叠蛋白应答(UPR)和内质网相关蛋白降解(ERAD)途径的表达模式发生了明显改变。且WB结果显示,在NAFLD小鼠的肝脏中,IRE1α和PERK的水平显著增加,而p-eIF2α、ATF4和BiP的水平显著降低,这表明在代谢紊乱和肝脏内质网应激反应中UPR信号失调导致内质网负担增加。这些数据表明,在NAFLD小鼠模型中,肝脏内质网应激反应受损 。  

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图2 NAFLD小鼠功能通路分析

 

3.  内质网应激下肝细胞MUP1的表达降低

接下来,作者将NAFLD小鼠和对照小鼠腹腔注射衣霉素(Tm,一种内质网应激诱导剂)或等量DMSO以建立肝脏内质网应激小鼠模型,蛋白质检测结果显示MUPs的水平在肝脏内质网应激模型中显著降低。WB分析证实了MUP1在肝脏中的类似表达模式。因此,MUPs被鉴定为代谢和内质网应激反应蛋白,这表明MUPs可能是NAFLD中内质网应激和代谢的潜在联系。

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图3 肝细胞中MUP的表达模式

 

4. 内质网应激诱导肝细胞内质网中MUP1聚集

为了解决MUP1响应内质网应激而降低的机制,对肝脏切片进行免疫荧光染色以确定MUP1在肝脏中的分布。共聚焦显微镜分析显示,与对照小鼠相比,MUP1保留在Tm小鼠的肝细胞内质网中。进一步表明内质网应激下MUP1在内质网中的滞留增加,这部分解释了细胞中成熟MUP1的减少

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图4 MUP1在肝脏中的分布

 

5. MUP1刺激肝细胞内质网中钙离子外流并诱导急性内质网应激

用MUP1处理原代肝细胞并进行RNA测序,GSEA分析显示,“钙信号通路”显著富集(图5B)。由于钙稳态对内质网稳态和细胞命运至关重要,因此,作者推测MUP1作为内质网应激反应蛋白,可能通过反馈参与内质网应激的调节。为了进一步研究MUP1对肝脏内质网应激的影响,用毒胡萝卜素(thapsigargin,Tg)作为调节Ca2+浓度的阳性对照。结果显示,MUP1处理瞬时刺激内质网应激途径。值得注意的是,MUP1对内质网应激的影响与Tg相似,表明MUP1对Ca2+稳态的潜在作用。而在无Ca2+溶剂中用MUP1处理,Ca2+从ER流出,显著增加了胞浆Ca2+浓度。这些数据表明,MUP1刺激肝细胞中的内质网钙离子外流并诱导急性内质网应激反应

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图5 MUP1对肝脏内质网应激的影响

 

6. MUP1预处理抑制蛋白质合成并减轻肝细胞内质网应激和胰岛素抵抗

为了进一步研究MUP1在短暂刺激内质网应激中的生理意义,将原代肝细胞用MUP1预处理后用Tm处理诱导应内质网应激。WB和转录组结果表明,Tm显著增加了内质网应激标志物的蛋白质水平,包括GADD34、ATF4、CHOP、XBP1s和p-eIF2α,而MUP1预处理可抑制ER应激。接下来,作者评估了抑制肝脏内质网应激对胰岛素反应的影响。MUP1预处理细胞受到内质网应激时,Akt显著增强,内质网应激标记物显著减弱,这表明胰岛素敏感性和肝内质网应激得到改善。该数据表明,MUP1预处理在体外减轻了肝脏内质网应激和内质网应激诱导的胰岛素抵抗

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图6 MUP1预处理减轻了肝细胞内质网应激和胰岛素抵抗

 

7. MUP1预处理减轻Tm诱导的肝脏内质网应激

为了评估MUP1在体内的病理生理作用,用MUP1预处理小鼠然后腹腔注射Tm以建立急性内质网应激模型,Tm处理导致明显的肝脏甘油三酯积聚和空泡化,MUP1预处理组有所改善,结果表明MUP1预处理减轻了Tm诱导的过度肝脏脂肪变性。同时,作者还研究了肾脏中的内质网应激反应。有趣的是,MUP1预处理显著减轻了Tm诱导的肾内质网应激,这表明MUP1对体内内质网应激反应的影响 

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图7 MUP1在体内的病理生理作用

 

 

 小编小结

在这项研究中,作者提供了肝脏MUPs显著降低导致内质网应激受损的证据。MUP1作为MUP家族中最丰富的成员,由内质网合成和加工,它受到内质网应激的负调节。从机制上讲,肝脏内质网应激导致MUP1形成聚集体并被困在内质网中,从而减少MUP1的分泌。此外,在肝细胞中补充重组MUP1增加了内质网钙离子外流至胞浆中,并短暂诱导预适应内质网应激,这有助于肝细胞通过抑制蛋白质合成来减轻化学诱导的内质网应激和内质网应激诱导的胰岛素抵抗,表明NAFLD的潜在治疗靶点。