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CRISPR-Cas9技术:sgRNA合成与转染实现精准基因修饰

2023-05-29
中科新生命
6306

CRISPR/Cas9技术

CRISPR-Cas9技术

CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过单向导sgRNA识别目的基因组序列,引导Cas9核酸酶对基因组进行有效切割,形成DNA双链断裂,通过细胞自身修复机制实现基因敲除、敲入、突变等,达到基因编辑目的。由于CRISPR-Cas9技术靶向灵活、编辑效率高、操作简便等特点逐步被应用于基因改造、药物开发、遗传病治疗等方面。

 

图1.CRISPR/Cas9系统的组成部分

△图1.CRISPR/Cas9系统的组成部分【1】

 

sgRNA简介

什么是gRNA?

gRNA (或称向导 RNA)是 CRISPR-Cas9 系统的一部分。gRNA 分子有两个组分:一个靶点特异性 CRISPR RNA (crRNA) 和一个辅助性的反式激活 crRNA (tracrRNA)。gRNA 通过 20-mer crRNA 序列与靶基因组序列之间的碱基配对,引导Cas蛋白复合物对相应位点进行切割,决定编辑位点特异性。

什么是SgRNA?

sgRNA 代表单向导 RNA【2】。将crRNA和tracrRNA改造成单个长 RNA,长度通常为 100 nt仍然具有双链DNA的剪切功能【3】(图2)。可以从载体表达或化学合成。

图2.sgRNA的组成

图2.sgRNA的组成

为什么选择sgRNA而不是crRNA : tracrRNA?

• 操作便捷:无需退火操作使crRNA和tracrRNA结合

• 更稳定:与Cas9蛋白结合更牢固

• 编辑效率更高:提高实验效率与成功率,原代细胞、干细胞优选

 

 

sgRNA合成

化学合成sgRNA一般是指通过特殊算法设计,利用高通量化学合成平台,高效合成序列100%正确,且具有功能性蛋白敲除能力的sgRNA。同时,在sgRNA的5’和3’端各加3个硫代和甲氧基修饰,可以提高sgRNA稳定性,并降低脱靶效应【4】

sgRNA合成

sgRNA转染方式

在CRISPR-Cas9系统中,利用Cas9和化学合成sgRNA形成的核糖核蛋白(RNP)替代传统的质粒、慢病毒转染模式,具有简单快捷、脱靶效应低、编辑效率高、转染效率高,无细胞毒性,无DNA干扰等优势,逐渐成为基因编辑基础科研实验的绝佳选择。如图3所示:

sgRNA转染方式

△图3.RNP转染

 

 

【1】 Song G, Jia M, Chen K, et al. ScienceDirect CRISPR / Cas 9: A powerful tool for crop genome editing. The Crop Journal. 2016.

 

【2】Jinek, M.; East,A.; Cheng, A.; Lin, S.; Ma, E.; Doudna, J. RNA-programmed genomeediting in human cells. eLife. 2013. 2,e00471. doi:10.7554/elife.00471

 

【3】Jinek, M.;Chylinski, K.; Fonfara, I.; Hauer, M.; Doudna, J. A.; Charpentier,E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in AdaptiveBacterial Immunity. Science. 2012. 337(6096),816–821. doi:10.1126/science.1225829

【4】Hendel, A.; Bak,R. O.; Clark, J. T.; Kennedy, A. B.; Ryan, D. E.; Roy, S.; Steinfeld,I.; Lunstad, B.D.; Kaiser, R.J.; Wilkens, A. B.; Bacchetta, R.;Tsalenko, A.; Dellinger, D.; Bruhn, L.; Porteus, M. H. Chemicallymodified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in humanprimary cells. Nature Biotechnology. 2015. 33(9),985–989. doi:10.1038/nbt.3290